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Analyses bactériologiques: 1-Méthodes analytiques utilisées: La recherche et le

Analyses bactériologiques: 1-Méthodes analytiques utilisées: La recherche et le dénombrement des bactéries indicatrices d’une contamination fécale comprennent deux méthodes classiques : 1- L’une, par filtration sur membrane. 2- L’autre, par ensemencement. 1.1-Méthode de filtration sur membrane: se fait a l'aide d'une rampe de filtration lié à une pompe selon les étapes suivantes: -préparer une zone stérile (à l'aide de bec bunsen ) -placer autour du bec bunsen les boites des milieux de culture préparée préablement . -stériliser la face supérieure (la plaque poreuse )et les entonnoirs de l'appareil à l'aide du bec bunsen . -procéder un refroidissement avec de l'eau distillé stérile . -placer la membrane stérile (membrane de 0.45 µm )sur le système de filtration avec une pince flamber et refroidie. -agiter le flacon par retournement . -verser le volume nécessaire de l'échantillon pour chaque paramètre. 1.2-Ensemencement: Mise en culture en zone stérile . -retirer la membrane avec la pince. -déposer la membrane sur la gélose . -les éléments nutritifs de la gélose traversant la membrane, ce qui permet le développement des bactéries en surface . 2-Recherche des indicateurs de contamination fécale: La recherche et la détermination de la présence ou l'absence des microorganismes dans les prélèvements des boues résiduaires ont été effectuées selon les normes ISO suivantes : 2.1-Recherche des coliformes totaux et fécaux: Les coliformes totaux sont des bacilles à Gram(-), non sporulé, oxydase (-), aérobie et anaérobie facultatifs. Ils se multiplient à 37°C pendant 48h. Ce type de germes peut être recherché et dénombré dans le milieu de culture BCPL(Tefyeche, 2014). Le terme de « coliformes fécaux » ou de « coliformes thermotolérants » correspond à des coliformes qui présentent les mêmes propriétés que les coliformes totaux après incubation à la température de 44 °C. Ce type de germes peut être recherché et dénombré dans l’eau peptonée exempte d’indole (Rodier, 2009). Afin d’examiner ces 2 types de germes on réalise les 2 tests suivants : A. Teste présomptif : A partir de l’eau testée, on porte aseptiquement : ü03 fois10 ml, dans 03 tubes contenant 9ml de milieu BCPL D/C muni d’une cloche de Durham. ü03 fois 01 ml, dans 03 tubes contenant 9 ml de milieu BCPL S/C muni d’une cloche de Durham. ü03 fois 0.1 ml, dans 03 tubes contenant 9 ml de milieu BCPL S/C muni d’une cloche de Durham. ØLecture : Après 48 Heures d’incubation à 37°C et en absence d’air, seront considérés comme positifs les tubes qui présentent à la fois un trouble microbien accompagné d’un virage du milieu au jaune et un dégagement gazeux se considèrent comme positifs. Le dénombrement des coliformes se fait selon les prescriptions de la table du NPP (Rejsek, 2002). B. Test confirmatif : Les tubes de BCPL qui montrent un résultat positif après le test de présomption font l’objet d’un repiquage à l’aide d’un ose bouclé dans des tubes contenant le milieu eau peptonée exempte d’indole l’incubation se fait à 44 °C pendant 24 heures (Rejsek, 2002). ØLecture: Les tubes qui présentent à la fois un anneau rouge en surface (Témoin de la production d’indole par Escherichia Coli), après adjonction de 2 à 3 gouttes du réactif de Kovacs et un dégagement gazeux se considèrent comme positifs (Fig.1). Le dénombrement s’effectue également selon les prescriptions de la table du NPP (Rejsek, 2002). Figure 1: Recherche et dénombrement des coliformes totaux et fécaux 2.2-Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux Les streptocoques du groupe D (possèdent l’antigène du groupe D) sont des coques à Gram (+), catalase(-), immobile, anaérobie facultatif, et non sporulant formant quand ils sont cultivés en milieu liquide des diplocoques et/ou des chainettes (Gillespi, 2006). On fait 2 tests successivement : un test présomptif en milieu de Rothe, et un test confirmatif en milieu Eva-Litsky. L’incubation dans les 2 tests se fait en 37°C pendant 24 à48h (Rodier, 2009). A-Teste présomptif : Ø Mode opératoire : * A partir de l’eau à analyser, porter aseptiquement 1 ml dans un tube contenant 9 ml de milieu Rothe S/C pour obtenir la dilution10-1. * Prélevé 1ml de tube précédent 10-1et mettre dans le seconde tube contenant 9 ml de milieu Rothe S/C pour avoir la dilution 10 2. ₋ * Transférer 1ml de la dilution 10 2dans un tube contenant 9 ml de milieu Rothe S/C, pour obtenir la dilution10 3. ₋ ₋ * Refaire la technique pour les 2 autres séries. L’incubation se fait à 37°C pendant 24 à 48 heures (Rejsek, 2002; Délarras, 2008). Ø Lecture: Les tubes présentant un trouble microbien seront considérés comme positifs (Fig.24) et la lecture finale s’effectue également selon les prescriptions de la table du NPP (Rejsek, 2002;Délarras, 2008). B.Test confirmatif: Ø Mode opératoire: Le test de confirmation est basé sur la confirmation des streptocoques du groupe (D)éventuellement présents dans le test de présomption. Les tubes de Rothe trouvés positifs feront donc l’objet d’un repiquage à l’aide d’un ose bouclé dans un tube contenant le milieu Eva-Litsky, bien mélangé le milieu et l’inoculum (Rejsek, 2002). L’incubation se fait cette fois ci à 37°C, pendant 24 heures (Délarras, 2003). Ø Lecture: Seront considérés comme positifs les tubes présentant à la fois: ü Un trouble microbien. ü Une pastille violette (blanchâtre) au fond de tube (Fig.2). La lecture finale s’effectue également selon les prescriptions de la table du NPP(Lebres, 2006). Figure 2 : Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux. 2.3-Recherche et dénombrement des spores anaérobies sulfito-réducteurs: Cette recherche concerne les bactéries anaérobies strictes, parmi ces bactéries figure le genre Clostridium (Rejsek, 2002), il s’agit de bacille Gram (+) presque toujours mobile(Pilet et al., 1987) ; elles ont la possibilité de se transformer sous une forme de spores résistantes aux conditions défavorables. (Rejsek, 2002) ; elles se développent en 24 à 48heures à une température de 36 ± 2°C (Lebres et Mouffok, 2008). Les ASR se développent sur une gélose VF en donnant des colonies typiques de couleur noire en réduisant les sulfites en sulfures, et en présence de Fe2+(ion de fer) donne FeS (Rejsek, 2002). ØMode opératoire: À partir de la solution mère : ü Prendre environ 20 ml dans un flacon stérile puis le soumettre à un chauffage à 80°Cpendant 8 à 10 minutes dans le but de détruire toutes les formes végétatives des ASR éventuellement présentes. ü Refroidir immédiatement le flacon sous l’eau de robinet. ü Répartir ensuite le contenu de ce flacon dans 4 tubes stériles, à raison de 5ml par tube. ü Ajouter environ 20 ml de gélose VF, fondue et additionnée d’une ampoule d’Alun de fer et d’une ampoule de Sulfite de sodium. ü Mélanger doucement le milieu et l’inoculum en évitant les bulles d’air. Laisser solidifier sur paillasse pendant 30 minutes environ, puis incuber à 37°C, pendant 24 à48 heures (Labres, 2006). ØLecture: ü La lecture se fera après 24 heures et après 48 heures. Dénombrer toute colonie noire d’environ 0,5 mm de diamètre, poussant en masse (Fig.3)(Rejsek, 2002). Figure 3 : Recherche et dénombrement des ASR 3-Recherche des germes pathogènes: Il existe une grande variété de bactéries pathogènes ou potentiellement pathogènes(opportunistes) pour l’homme. Celles-ci vivent ou survivent dans l’environnement, soit provenant des rejets humains, éliminées par des sujets malades ou des porteurs sains, soit étant autochtones et pouvant s’adapter à l’homme (RODIER et al., 2009). Pour rechercher et identifier les bactéries, nous avons utilisé la technique d’ensemencement par râteau sur gélose coulée dans des boites de Pétri. Les milieux utilisés sont : GN, GNAB, Chapman, Hektoen, SS, Mac Conckey (in BOUCHAALA, 2010). 3.1-Pseudomonas Un bacille Gram (-), Oxydase (+), Capable de produire de l’ammoniac à partir de l’acétamide. Pseudomonas aeruginosa, est également une bactérie hautement pathogène et résistante à plusieurs antibiotiques. ØMode opératoire: üFiltration de 100 ml de l'échantillon sur une membrane retenant les bactéries. ücette membrane est placée sur un milieu de culture sélectif cétrémide incubé à 37 c° pendant 48 h. ØLecture: üAprès incubation ,considérer comme typique toutes les colonies lisses et brillantes avec une couleur blanc crème et un aspect muqueux. üRepiquage des colonies caractéristiques sur la gélose GN, incubé à 37 c° pendant 24 h. 3.2-Salmonella : Ce sont des bacilles à Gram (-), non sporulés, le plus souvent mobiles, elles fermentent le Glucose avec ou sans production de gaz et réduisent les nitrates en nitrites, elles sont oxydases (-), catalases (+) et aérobie-anaérobie facultative (Souna, 2011). La recherche de Salmonella à partir des prélèvements de la SM est souvent compliquée par leur faible concentration, il est nécessaire de pratiquer une méthode d’enrichissement. Au début, les bactéries qui nous intéressent sont diluées dans une population beaucoup plus nombreuse et très hétérogène que nous éliminons peu à peu au fil de transferts successifs à l’aide d’un milieu sélectif adéquat. Les cellules les mieux adaptées se multiplient plus vite quels autres et tendent à devenir majoritaires. Un simple étalement sur boite gélosée et la collecte d’une colonie isolée permettent facilement d’obtenir une souche présumée pure(PELMONT, 1996). ØMode opératoire: Ø Premier jour : Enrichissement Introduire 1ml de l’échantillon de l’eau à analyser dans 10ml de SFB puis incuber à 37C°(Navoun,2005). ØDeuxième jour : uploads/Geographie/ analyses-bacteriologiques.pdf