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Revue « Nature et Technologie ». n° 03/Juin 2010. Pages 13 à 20 13 Etude de l’a

Revue « Nature et Technologie ». n° 03/Juin 2010. Pages 13 à 20 13 Etude de l’activité antimicrobienne des souches de lactobacilles thermophiles utilisées dans l’industrie laitière. Fella Naouel ALLOUCHEa*, Amina HELLALb., Abdenour LARABAc. aDivision Bioénergie et Environnement. Centre de Développement des Energies Renouvelables.B.P.62, route de l’observatoire. Bouzareah – Algérie. *Ecole Nationale Supérieure Agronomique. EL Harrach. Algérie bEcole Nationale Polytechnique El Harrach. Département de Génie de l’Environnement. Algérie cHôpital universitaire de Bab el Oued. Service pédiatrie. Algérie Résumé Cette étude a été inspirée des problèmes rencontrés dans l’industrie laitière et illustre l’importance antimicrobienne des lactobacilles vis-à- vis des germes d’altération. Dix souches de lactobacilles thermophiles appartenant aux espèces: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus lactis, Lactobacillus bulgaricus) ont été isolées sur milieu MRS à partir du lait cru et d'un ferment lactique commercial pour l'étude de leur activité antimicrobienne contre des germes Gram positifs et Gram négatifs. Les résultats de l’activité antimicrobienne ont révélé que toutes les souches de Lactobacillus isolées produisent et excrètent dans le milieu de culture des substances inhibitrices capables d'inhiber la croissance de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. L’étude des cinétiques de croissance et d’excrétion, nous a permis de choisir une souche de Lactobacillus acidophilus comme souche modèle pour la production et la purification de bactériocine. Une caractérisation physico-chimique nous a permis d’observer que la bactériocine présente une faible thermorésistance et un pH optimum de 5. L'activité bactériocinogénique est détruite par 121°C pendant 20 mn. La stabilité de la bactériocine a été détectée à une température de 45° C et à une gamme de pH comprise entre 5 à 6. La bactériocine conserve toute son activité pendant 7 jours à une température à + 4°C et – 20°C. L’activité est entièrement détruite sous l’action des enzymes protéolytiques, ce qui indique que la partie biologiquement active est de nature protéique. Ces propriétés suggèrent que cette substance inhibitrice est considérée comme substance de type « Bactériocine ». L’ensemble de ces résultats souligne l’importance de l’activité antimicrobienne des lactobacilles dans l’industrie laitière. Mots clés : Lactobacillus; Bactériocine; Substances antimicrobiennes; inhibition des germes pathogènes. 1. Introduction Les bactéries lactiques sont connues pour leur capacité à produire lors de leur croissance des composés actifs à savoir les acides organiques qui acidifient le milieu, des dérivés du métabolisme de l’oxygène (H2O2) et des substances naturelles de nature protéique douées d’une activité antagoniste à l’encontre d’un grand nombre de germes d’altération, leur permettant de se développer préférentiellement dans divers écosystèmes [1] [2] [3]. Parmi ces substances synthétisées, des peptides dénommés bactériocines, sont produits puis excrétés à l’extérieur des cellules productrices. Ils présentent une activité bactéricide ou bactériostatique. Leur spectre d’activité peut être plus ou moins large, quelquefois limité aux espèces proches phylogénétiquement des bactéries productrices [2] [4]. De nombreuses possibilités d’utilisation ont été envisagées, pour répondre aux besoins de l’industrie alimentaire, cosmétique et de la médecine. Ces nouvelles substances naturelles produites par des souches bactériennes universellement reconnues d’usage alimentaire dirigées contre des germes pathogènes pourraient être utilisées comme agent de conservation sous forme d’additif, soit d’inoculum bactérien producteur de bactériocines au cours du processus de fabrication, permettant ainsi de diminuer le nombre d’intoxications alimentaires et d’augmenter la durée de conservation et de commercialisation. Par exemple, la nisine produite par la souche Lactococcus lactis, est autorisée et utilisée à cet effet dans certains aliments [5]. L’objectif de notre travail consiste à isoler des souches de lactobacilles thermophiles à partir du lait cru et d’un ferment lactique thermophile commercial; la mise en Nature & Technologie Etude de l’activité antimicrobienne des souches lactobacilles utilisées dans l’industrie laitière 14 évidence de l’activité antimicrobienne des souches Lactobacillus sélectionnées; étudier par la suite la cinétique de croissance des souches Lactobacillus sélectionnées; extraire et purifier la bactériocine à partir de la souche Lactobacillus la plus performante et déterminer les propriétés physico-chimiques de la bactériocine purifiée. Enfin, c’est sur cette base de données, que nous essayerons d’étudier au laboratoire, l’activité antimicrobienne des souches de lactobacilles thermophiles vis à vis des germes cibles. 2. Matériel et méthodes 2.1. Bactéries et conditions de culture L’isolement des lactobacilles a été effectué à partir du lait cru et lben traditionnel préparé à partir de différents échantillons de lait cru récolté à la ferme expérimentale de l’INA El Harrach et d’un ferment lactique commercial (Danimax-food , ORLAC Birkhadem). L’isolement des lactobacilles a été effectué sur le milieu MRS à pH 6,2, incubé à 42°C pendant 72 heures, en anaérobiose [6]. Les souches ont subi par la suite des tests d’identification spécifiques. Le milieu de production de bactériocine utilisé est le milieu MRS à pH 6,8 préconisé par Barefoot et Klaenhammer ; Barefoot et al. [7] [8]. Afin de détecter le spectre d’activité des espèces lactobacilles sélectionnées, nous avons testé les souches contre un certain nombre de germes indésirables. Les souches cibles utilisées pour l’étude de l’activité bactériocinogénique proviennent des collections (ATCC, IPA) fournies par l’Institut Pasteur d’Algérie (IPA) (tableau1). Des tests de caractérisation culturaux et morphologiques (Gram, catalase et oxydase) sont effectués au préalable. Les résultats des tests de caractérisation ont été comparés avec ceux obtenus par Holt (1994) dans Bergey’s Manuel of Determinative Bactériology 9 th Edition. 2.2. Préparation de l’extrait bactériocinique Une culture de lactobacilles thermophiles a été effectuée dans le milieu MRS à pH 6,8, incubation à 37°C, dans une jarre d’anaérobiose. Le surnageant contenant l’extrait brut bactériocinique est récupéré par centrifugation est ajusté à pH neutre 6,5 à 7 avec du NaOH 10 M. La neutralisation de l’extrait bactériocinique permet d’éliminer l’effet des acides organiques. L’extrait est ensuite filtré sur filtres Millipore stériles de diamètre 0,22 µm, l’activité antimicrobienne est déterminée pour chaque souche de lactobacille sélectionnée. 2.3. Essai de l’activité bactériocinogénique Afin de minimiser l’influence de l’effet inhibiteur du peroxyde d’hydrogène; les boites de Pétri sont ensemencées avec le germe cible en profondeur et en double couche dans la gélose nutritive selon la technique de diffusion des puits préconisée par Tagg et Mc Given [9] puis reprit et modifiée par plusieurs auteurs (Schillinger et Lucke ; Ten brink et al. ; Jin et al.) [10] [11] [12]. 20 ml de milieu gélosé, sont recouvertes avec 5 ml de milieu semi-solide (0,7 % d’agar) préalablement ensemencé avec 0,05 ml de la suspension de souche cible dilution 10-1. Sur les boites de Pétri inoculées par les germes cibles préparées préalablement, on réalise des puits (diamètre de 4,5 mm) qui sont remplis par la suite par 50 µl de l’extrait bactériocinique brut. Les boites de Pétri ainsi préparées sont pré-incubées pendant 2 à 4 heures à + 4 °C, afin de permettre la diffusion radiale de l’agent inhibiteur ensuite suivit par une incubation 18 à 24 heures, à 37 °C en anaérobiose, afin d’éviter la présence de l’air nécessaire à la production de peroxyde d’hydrogène [13]. En fin d’incubation, on observe les zones d’inhibition autour des puits, pour les différentes souches sélectionnées vis-à-vis des germes cibles testés. La lecture de l’activité bactériocinogénique se fait par la mesure du diamètre d’inhibition autour du puits, exprimée en mm [14]. 2.4. Etude de l’évolution de la cinétique de croissance et de production L’étude de l’évolution de la croissance des lactobacilles thermophiles sélectionnés est effectuée dans le milieu MRS à pH 6,8, incubation à 37 °C, en anaérobiose. Des prélèvements stériles sont effectués périodiquement afin d’évaluer la croissance (DO) à 560 nm, le pH ainsi que la détermination de l’activité bactériocinogénique vis à vis des germes cibles. 2.5. Purification de la bactériocine Afin d’extraire et de purifier la fraction bactériocinique, une méthode d’extraction simple, fondée sur l’emploi de (NaCl) a été développée. La méthode d’extraction acide a pour principe l’adsorption et la désorption des molécules sur les cellules productrices de bactériocines préconisée par Yang et al. [15]. 2.5.1. Détermination du pH optimum d’action, de la thermorésistance Le pH optimum d’action de la bactériocine purifiée est mis en évidence par la variation du pH, l’extrait bactériocinique est ajusté à des valeurs de pH variant de 2 à 10 avec HCl, 1 mole L-1 ou du NaOH 1 mole L-1. Après incubation pendant 1 heure 30 mn à 37 °C, l’activité bactériocinogénique est ensuite testée vis-à-vis de Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus par la méthode de diffusion des puits [16] [17]. Pour la détermination de la thermorésistance de la bactériocine, différentes fractions d’extraits bactériociniques purifiés sont soumises à un traitement thermique à 40 °C, 45 °C, 50 °C, 60 °C, 80 °C et 100 °C pendant 1 mn et enfin un cycle d’autoclavage à 121 °C pendant 20 minutes à pH optimum (pH 5) [11] [17]. Après refroidissement, l’activité de la bactériocine est vérifiée vis-à-vis de Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus. Revue « Nature et Technologie ». n° 03/Juin 2010 15 Tableau 1 Référence des souches cibles. ATCC: American Type Culture Collection; IPA: Institut Pasteur d’Alger. 2.5.2. Détermination de la stabilité thermique de la bactériocine au cours du stockage Afin d’examiner la stabilité thermique de la bactériocine au cours du stockage, différentes fractions d’extraits bactériociniques purifiées sont conservées à pH optimum à des températures différentes: à 37 °C uploads/Geographie/ art-03-02.pdf