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Matériels& méthodes 15 1. Matériels 1.1. Matériels biologiques 1.1.1. Souche ét

Matériels& méthodes 15 1. Matériels 1.1. Matériels biologiques 1.1.1. Souche étudiées Sont inclus dans cette étude des souches d'Escherichia coli, isolées à partir de divers prélèvements (sonde urinaire, prélèvement rectal, plaie et environnements), au nivaux de deux services (traumatologie et médecine interne) du CHU de Tlemcen. 1 .1.2. Souches de références  ATCC 27853 : Pseudomonas aeruginosa de phénotype sauvage ;  K 12 : Escherichia coli résistance à la rifampicine ;  Kp nasey : Klebsiella pneumoniae. 1.2. Milieux de culture 1.2.1. Milieux de culture liquides  Bouillon nutritif (BN) (Fluka)  Bouillon cœur cerveau (BHIB) (Fluka) 1.2.2. Milieux de culture solides  Gélose nutritive (GN)  Milieu Mac Conkey (MC) (Fluka)  Milieu Muller-Hinton (MH) (Fluka)  Milieu triple sucres (TSI) 1.3. Solutions et tampons  Eau ultra pure  Eau distillées stérile  Solution de BET 1.4. Antibiotiques 1.4.1. En disque  Les β-lactamines: Amoxicilline (AMX), amoxicilline/acide clavulanique (AMC), ceftazidime (CAZ), Imipénéme (IMP), Aztréonam (ATM), céfoxitine (FOX) et céfotaxime (CTX).  Les aminosides : amikacine (AK), Gentamicine (GN)  Les quinolones : acide nalidixique (NA), norfloxacine (NOR) et céprofloxacine(CIP) Matériels& méthodes 16  Autre : colistine (CS) 1.4.2. En poudre Céftazidime (CAZ), céfotaxime (CTX), céprofloxacine (CIP), Aztréonam (ATM), amikacine (AK), céfépime (FEP) et fosfomycine sont des poudres à concentration. 2. Méthodes 2.1. Prélèvements Les prélèvements ont été réalisés par écouvillonnage sur des plaies, des sondes urinaires les urine, des pus et environnement, puis transportés à température basse ou froid 4°C, au laboratoire (l’écouvillon est introduit dans un tube contenant du bouillon nutritif), ensuite incubés dans l’étuve à 37°C pendants 24 heures. 2.2. Isolement et purification L’isolement est réalisé sur gélose Mac Conkey, milieu sélectif pour les entérobactéries et on porte à incubation pendent 24 heures à 37°C. On réalise la purification des souches par plusieurs passages successifs sur gélose par strie Mac Conkey afin d'obtenir des souches jeunes et pures. 2.3. Identification 2.3.1. Test TSI (milieu tripe sucres) Le milieu TSI est ensemencé par piqure central de culot et par stries sur la pente. Après incubation à 37°C pendant 24 heures, ce test permet la mise en évidence de l'utilisation de glucose, lactose et du saccharose avec ou sans dégagement de gaz. La coloration jaune est due à l'acidification du milieu au niveau de la pente après la fermentation du glucose et ou saccharose. La production d’hydrogène sulfuré (H2S) se révèle par une coloration noire due à la transformation du sulfure de fer par réduction de sulfate ferreux dans le milieu. 2.3.2. Galerie API 20 E (Bio Mérieux)  Principe La galerie API 20 E comporte 20 microtubes contenant des substrats sous forme déshydratés. Les tests sont inoculés avec une suspension bactérienne qui reconstituée les milieux. Les réactions produites pendant la période d'incubation se traduisent par des virages colorés spontanés ou révélés par l'addition de réactifs. Matériels& méthodes 17  Mode opératoires  Réunir fond et couvercle d'un boite d'incubation et répartir l'eau distillé dans les alvéoles pur créer une atmosphère humide.  Inscrire la référence ou le code de la souche sur la languette latérale de la boite.  Déposer la galerie dans la boite d'incubation.  Réaliser une suspension bactérienne par homogénéisation d'une seule colonie bien isolée sur milieu gélosé dans de l'eau physiologique (2ml).  Remplir tubes et cupules des tests: CIT, VP, GEL, avec la suspension bactérienne et avec la pipette ayant servi au prélèvement.  Remplir uniquement les tubes (et non les cupules) des autres tests.  Remplir d'huile de paraffines les cupules des tests soulignés: URE, H2S, ODC, LDC, ADH afin de créer l'anaérobiose.  Fermer la boite d'incubation et la placer à 37°C pendant 24 heures.  Lecture  Après incubation, la lecture de la galerie est réalisée en se référant au tableau de lecture (annexe 2).  Noter sur la fiche de résultats toutes réactions spontanées.  Révéler les testes nécessitant l'addition de réactifs.  Avec le tableau d'incubation, comparer les réactions notées sur la fiche de résultats avec celles du tableau (Bio Mérieuse). 2.4. Antibiogramme La méthode de diffusion des antibiotiques en milieu solide est basée sur l'observation de la croissance bactérienne en présence d'un gradient de concentration d'antibiotique obtenu par diffusion à partir des disques dans le milieu gélosé. La fiabilité des résultants d'un antibiogramme est influencée par de nombreux paramètres qui doivent être rigoureusement contrôlés. La technique standard utilisée est celle préconisée par les documents émanant de la Société Française de Microbiologie (SFM) selon les normes du communiqué 2010. 2.4.1. Préparation d’inoculum Pour chacun des souches à tester, réaliser une suspension en ensemençant 2 ml d’eau physiologique stérile par 3 à 4 colonies à partir d’une souche pure. Le culture obtenue doit être de densité optique 0.08-0.1 à 625 nm à 108 UFC\ml. Matériels& méthodes 18 2.4.2. Ensemencement  Diluer la suspension d’inoculum au 1/100 dans de l’eau physiologique  Ensemencer par inondation (ou par écouvillonnage) sur milieu Muller Hinton  Rejeter l’excès puis sécher les boites 20 à 30 minutes à l’étuve. 2.4.3. Application des disques Déposer les disques d’antibiotiques à l’aide d’une pince stérile en suivant le schéma de VEDEL pour les entérobactéries (figure 7) Figure 7. Disposition des disques d’antibiotique sur les boites d’antibiogrammes. 2.4.4. Lecture Après 24 heures d’incubation, mesurer les diamètres d’inhibition et se référer aux valeurs critiques de CA-SFM (Annexe 3), ensuite interpréter les phénotypes de résistance. 2.5. Test à la cloxacilline (Brasme et al., 2009) 2.5.1. Principe  La cloxacilline est un antibiotique qui permit d’inhiber les β-lactamase de type AmpC. 2.5.2. Techniques  Réaliser un antibiogramme par diffusion sur gélose Müller-Hinton additionné de cloxacilline à 500 μg/ml et à 1000 μg/ml. 2.5.3. Lecture  On observe une restauration de l’activité des céphalosporines de 3ème génération. AMX CAZ CTX AMC ERTA IMP ATM NA AN CN CS CIP NOR FOX Matériels& méthodes 19 2.6. Détermination de Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) en milieu solide 2.6.1. Principe La méthode de dilution successive en milieu solide est la méthode de référence pour déterminer la sensibilité bactérienne aux antibiotiques. Elle consiste à mettre un inoculum bactrien standardisé au contact de concentrations croissantes d’antibiotiques. 2.6.2. Technique Pour chacun d’antibiotiques, préparer une solution mère à 5120 mg/l puis réaliser des dilutions séries de progression géométrique de raison ½ (Annexe 4).  Distribuer 2 ml de chaque dilution d’antibiotique dans une série de boite de pétri ainsi que 2 ml d’eau distillée stérile dans une boite de pétri témoin;  Ajouter 18 ml de milieu Mueller Hinton gélosé maintenu en surfusion ;  Bien mélanger et laisser solidifier ;  Sécher les boites 30 mn à l’étuve à l’étuve à 37°C.  Préparer des suspensions de 108 UFC/ml pour chacune des souches à tester  Diluer la suspension d’inoculum au 1/10 ;  Ensemencer par spot 1 à 2 µl de la suspension bactérienne, soit un inoculum de 104 UFC/spot.  Incuber à 37°C pendants 24 H. 2.6.3. Lecture  S’assurer de la croissance des souches au niveau de la boite témoin ;  La concentration minimale inhibitrice est définie comme étant la plus faible concentration ou il n’y a par de croissance visible. La présence d’une ou de deux colonies ou d’un fin film n’est pas prise en considération. 2.7. Transfert des plasmides par conjugaison (Touati, 2006) 2.7.1. Principe La conjugaison représente le phénomène de contact physique par lequel les plasmides peuvent passer d’une cellule donatrice à une autre réceptrice (K 12). La sélection des transconjugants s’effectue en présence de 2 antibiotiques : l’un correspond à l’une des résistances transférées, l’autre à la résistance non transférable de la souche réceptrice. 2 .7.2. Technique Matériels& méthodes 20  Ensemencer la souche réceptrice la K 12 et les souches donatrices en bouillon BHIB et incuber à 37°C pendants 24h ;  Réaliser un mélange donatrice réceptrice dans un rapport 1 :10 ;  Mélanger par inversion ;  Incuber à 37°C pendants 24h ;  Ensemencer par strie le mélange sur un milieu de sélection ;  Vérifier la sélectivité des milieux de sélection en ensemençant la souche donatrice et la souche réceptrice sur la même boite;  Incuber à 37°C pendants 24h. 2.7.3. Préparation de boites de sélections La sélection a été faite sur Mac Conkey (18 ml) additionné de 1ml de Céfotaxime et 1 ml de Rifampicine à des concentrations finales de 16 µg/ml et de 256 µg/ml respectivement. 2.7.4. Lecture Analyser les transconjugants en réalisant des antibiogrammes. 2.8. Amplification par réaction de la polymérisation en chaine (PCR). En biologie moléculaire, une des techniques les plus élémentaires et la PCR. La réaction PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d’amplifier in vitro une région spécifique d’un acide nucléique donné afin d’en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier. Pour se faire, une série de réactions permettant la réplication d’une matrice d’ADN double brin est répétée en boucle. Ainsi, au cours de la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant, l’amplification est donc exponentielle (Borde, 2006). 2 .8.1. Technique  Préparation de la réaction Chaque uploads/Geographie/ materiels-methodes-1-materiels-1-1-materiels-biologiques-1-1-1-souche-etudiees.pdf