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• Méthodes de dilution  En milieu liquide (bouillon) – méthodes de micro- ou m

• Méthodes de dilution  En milieu liquide (bouillon) – méthodes de micro- ou macro-dilution - Tubes (puits) de milieu + antibiotique (C° croissantes) - Inoculation avec une population standard de l'organisme testé - Transfert d'un échantillon des tubes (puits) sans croissance dans un milieu frais dépourvu d'antibiotique (liquide, ou sur milieu solide) 1/ 2/ 1/ Après incubation Antibio (µg/mL) 0 0,125 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 2/ Après incubation CML (ou CMB) CMI CMI = 2 µg/mL CML = 16 µg/mL (CMB) II.3- La détermination du niveau de l'activité antimicrobienne Estimation de l’agent et de la dose thérapeutique appropriés Essentiel pour une thérapie appropriée II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 110 Incubation Incubation Détermination de la CMI (Test en macro-dilution) II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 111 (M. Archambaud, 2009) µg/mL µg/mL = 2 µg/mL 112 Détermination de la CMI (Test en micro-dilution) II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE Microplaque 96 puits http://www.nios.ac.in/media/documents/dmlt/Microbiology/Lesson-12.pdf II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 0.06 Transfert d’un échantillon sur milieu solide puis incubation 113 CMI = 0,5 mg/L CML = 2 mg/L Détermination de la CMI et de la CML (ou CMB) II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 114 (M. Archambaud, 2009)  En milieu solide (gélose) = méthode de référence - Antibiotique incorporé dans le milieu gélosé - Inoculation avec ≠ souches 4 souches testées CMI II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 115 • Méthodes de dilution µg/mL Incubation Inoculateur à têtes multiples (appareil de Steers) Plus de 20 souches ensemencées par boîte • Méthodes de dilution  En milieu solide (gélose) Détermination de la CMI II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 116 • Méthodes de dilution  En milieu solide (gélose) Détermination de la CMI II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 117 • Méthode de diffusion : la méthode des disques (méthode de Kirby-Bauer) Principe simple Mesure de l'activité antibactérienne des antibiotiques = antibiogramme standard Diamètre du halo = fonction de la - Sensibilité de la souche, - Concentration de l’inoculum bactérien, - Solubilité et vitesse de diffusion de l'antibiotique. Standardisation des paramètres - Nature et quantité de milieu - Concentration de l'inoculum - Diamètre du disque et quantité d'antibiotique sur le disque - Disque imprégné d’ATB placé sur gélose inoculée préalablement - Diffusion radiale de l’ATB dans la gélose gradient de concentration - Incubation - Halo clair si inhibition de croissance Comparaison directe de 2 ATB impossible II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 118 Lecture des résultats de l’antibiogramme possible (droites de concordance) Droites de concordance (ou droites de régression) pré-établies - Par des laboratoires spécialisés - Dans des conditions standardisées - Avec Niveau de résistance (S, I ou R) Droite de concordance établie pour l'amoxicilline avec un disque chargé à 25 µg • une centaine de souches de sensibilités ≠ • au moins 4 genres ≠ CMI (log2) en µg/mL Diamètre du halo en mm En théorie, dans les conditions standards, on obtient CMI d’une souche en fonction du diamètre du halo En pratique : résultats qualitatifs car - Variabilité expérimentale des diamètres - Erreurs pente & ordonnée à l’origine des courbes Pour un antibiotique donné : II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 119 (déterminée par méthode de dilution) (mesuré par méthode de diffusion) → Principe de la lecture d'un antibiogramme c C d D S I R R I S Sensibilité CMI ~ 32 µg/mL CMI > C & Diamètre d’inhib. < d Souche résistante (R) Diamètre d’inhibition = 10 mm II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 120 Bandelette de lecture Droite de concordance Valeurs critiques Un agent doit atteindre au siège de l’infection une [ ] > CMI du germe pathogène pour être efficace. CMI ≤ c (Ø ≥ D) : la souche est sensible (S) à l'antibiotique considéré. CMI > C (Ø < d) : la souche est résistante (R) à l'antibiotique considéré. c < CMI ≤ C (d ≤ Ø < D) : la souche est de sensibilité intermédiaire (I) → Principe de la lecture d'un antibiogramme - Généralisation Concentration critique supérieure (C) = + gde quantité d’antibiotique actif que l’on peut obtenir dans le sérum Concentration critique inférieure (c) = concentration sérique d’antibiotique actif obtenue après administration d'une dose normale Les valeurs de "c" et "C" sont définies pour chaque antibiotique. II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 121 A ces valeurs correspondent des diamètres de halo (Ø) critiques = d et D → Limites - Respect absolu des protocoles de standardisation - Valable pour des bactéries à croissance rapide (culture pure) - Technique peu adaptée pour des molécules d’ATB diffusant peu - Mesure effet bactériostatique (Quid effet –cide?) - Extrapolation à l’efficacité in vivo fonction des paramètres pharmacologiques - … → Traduction clinique - Souche S : Forte probabilité de succès thérapeutique - Souche R : Probabilité de succès thérapeutique très faible ou nulle - Souche I : Issue thérapeutique intermédiaire Traitement local ou général à posologie supérieure • Autres méthodes →Utilisation d’automates →E-test (Epsilometer-test) →Effet synergique de 2 antibiotiques II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 122 → Principe et résultat du E-test http://www.microbiologynotes.com/e-epsilometer-test-principle-purpose-procedure- result-interpretation-with-precaution-advantages-and-disadvantages/ www.biomerieux.fr/diagnostic-clinique/etest II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 123 - E-test appliqué sur gélose inoculée préalablement - Après incubation : observation d’une ellipse d’inhibition Association d’antibiotiques. Méthodes et résultats possibles → Effet synergique de 2 antibiotiques Association synergique Association antagoniste Association indifférente 1/ Mesure du rayon de chacune des zones d’inhibition 2/ Test d’association (distance entre les disques légèrement > à S rayons) II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 124 Méthode des disques 125 Association d’antibiotiques. Méthodes et résultats possibles → Effet synergique de 2 antibiotiques II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE (White et al., 1996) - ANTIMICROBIALAGENTS ANDCHEMOTHERAPY, Vol. 40, p. 1914–1918 E-testInhibition 126 Association d’antibiotiques. Méthodes et résultats possibles → Effet synergique de 2 antibiotiques II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE Figure 1: E- test cross method. In this example, minimum inhibitory concentration of A is 6 μg/ml and minimum inhibitory concentration of B is 8 μg/ml. After combination of A and B, minimum inhibitory concentration of A is 0.094 μg/ml and minimum inhibitory concentration of B is 0.75 μg/ml. (Laishram et al., 2017) DOI: 10.4103/ijmm.IJMM_17_189 E-test Cinétique de bactéricidie II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 127 T : Témoin A et B : Antibiotiques Association d’antibiotiques. Méthodes et résultats possibles → Effet synergique de 2 antibiotiques (M. Archambaud, 2009) II.4- Structure et modes d'action des substances antimicrobiennes • Structure chimique Complexe en général ( synthèse chimique difficile) Regroupement en familles / structure et mécanisme d'action https://www.slideshare.net/saurav9119/beta-lactam-antibiotics-43630735 Erythromycine Tetracycline Pénicilline II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 128 Bétalactamines Macrolides Tetracyclines  Inhibition de la synthèse de la paroi bactérienne → ATB les plus sélectifs → Indice thérapeutique élevé  Inhibition de la synthèse protéique → Fixation sur le ribosome procaryote (petite ou grande ss-u) → Indice thérapeutique relativement élevé  Inhibition de la synthèse des acides nucléiques (ADN ou ARN) ou  Détérioration des membranes cellulaires → Toxicité sélective moins élevée  Anti-métabolites → Analogues de structure d’intermédiaires métaboliques → Inhibition par compétition (blocage des voies métaboliques) • Modes d'action (Résumé : Tableau, diapositive suivante) Explication de la nature et du degré de toxicité sélective II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 129 II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 130 II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 131 Attention « protection » des bactéries - Liquides corporels contenant l’agent ne peuvent atteindre les bactéries - Agent absorbé par les matières environnantes (ex: caillots sanguins, matrice d’un biofilm) - Cas d’infections par bactéries intracellulaires (pénétration de l’ATB) 2/- Le germe doit être sensible à l’antibiotique - Bactéries en phase de latence résistantes à de nombreux antibiotiques II.5- Facteurs influençant l'efficacité des substances antimicrobiennes Mode d'administration important 1/- L’agent doit être capable d’atteindre le siège de l’infection - Voie orale en général (sauf si instabilité dans milieu stomacal acide) - Voie intramusculaire ou intraveineuse (ATB non absorbés à travers l’intestin) - Application locale Ex : Mycoplasmes résistants aux inhibiteurs de la synthèse de la paroi - En phase de croissance, sensibilité des microorganismes variable II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 132 3/- Concentration locale > CMI du microorganisme pathogène Concentration locale = fonction de - Quantité administrée - Voie d’administration - Vitesse d’absorption - Vitesse d’élimination du corps II.5- Facteurs influençant l'efficacité des substances antimicrobiennes 4/- Existence de plasmides de résistance aux antibiotiques Chimiothérapie moins efficace et plus complexe II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 133 II.6- La résistance bactérienne aux antibiotiques • Mécanismes (schématiquement 4) 1/- Par imperméabilité  Ex : Membrane externe Gram- / Pénicilline (résistance naturelle)  Ex : Modification de protéines liant la pénicilline (résistance acquise) • Définitions II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 134 2/- Par inactivation de l'antibiotique (modifications chimiques)  Dégradation de l’ATB par hydrolyse  Addition de groupes chimiques (ex : phosphorylation ou acétylation) 3/- Par altération de la cible cellulaire de l'antibiotique  Ex : Modification ARNr 4/- Par modification de la voie métabolique ciblée  Utilisation d’une voie alternative  Augmentation de la production du métabolite cible Lewis. Nature Reviews Drug Discovery 12, 371–387 (2013) From Coates, A. et al. The future challenges facing the development of new antimicrobial drugs. Nature Rev. Drug Discov. 1, 895–910 (2002). II- LA CHIMIOTHERAPIE ANTIMICROBIENNE 135 uploads/Geographie/ b44-microbio-l2sv-cours-5-2019-20.pdf