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Matériels et méthodes B.Matériel et méthode I. Echantillonnage C’est une étape

Matériels et méthodes B.Matériel et méthode I. Echantillonnage C’est une étape primordiale qui conditionne la qualité des résultats. Les échantillons doivent être toujours prélevés aves toutes les conditions d’asepsie nécessaires dans des contenants stériles de verre qui sont les tubes a essais de large ouverture , de capacité d’environ 250 ml , en laissant un espace d’air d’au moins 2,5 cm .On a cinq échantillons ( P1, P2, P 3, P4 et P5 ) ont été prélevés séparément de trois poissons d’élevage de type DAURADE de région de Monastir , et menés au laboratoire de microbiologie. Les prélèvements effectués à partir des viscères des poissons sont mis dans des bouillons MRS. Après l’incubation de 24 h dans une température de 37ºC est faite (dans l’étuve). Les bouillons MRS deviennent très troubles c'est-à-dire les bactéries commencent de croitre dans les bouillons. Les prélèvements effectués à partir des viscères des poissons ont permis d’obtenir, après les étalements sur les boites de pétri, plusieurs centaines des colonies sur le milieu de culture utilisé (MRS). Matériels et méthodes Figure 2 : les colonies des bactéries lactiques dans leurs bouillons MRS. II. Isolement des souches : L’isolement a été effectué sur un milieu de culture spéciale et sélectif pour les bactéries lactiques qui est le Man Rogosa et sharpe (MRS), l’isolement commence par le pré-enrichissement dans le bouillon MRS qui est un milieu liquide permettant la croissance des bactéries sans exigences particulières. En milieu aseptisé, on prélève tout les viscères des poissons et on les met dans le bouillon MRS, ensuite, on l’incube à l’étuve à 37°C pendant 24 heures. Cette étape permet aux bactéries stressées de récupérer leur stabilité. La deuxième étape est l’enrichissement sur des milieux liquides (MRS) simple avec le tween 80 pour favoriser la croissance des bactéries lactiques. Matériels et méthodes Les colonies prédominantes ont été collectées au hasard et les cultures pures ont été obtenues par repiquage par stries d’épuisement sur le même milieu gélosé. Figure.3. Culture des souches sur la gélose MRS. 1. Milieu MRS : Le milieu MRS ( milieu de de Man Rogosa et sharpe , de Man et al , 1960) est composé de 10 g/l de peptone de protéase n°3 , de 10g/ l d’extrait de baeuf , de 5g/ l d’extrait de levure , de 20 g/ l de glucose , de 1g / l de polysorbate 80 , de 2 g/l de citrate d’ammonium , de 5g/l d’acétate de sodium , de 0,1 g/ l de sulfate de magnésium , de 0,05 g/ l de sulfate de maganése et de 2 g/ l de phosphate dipotassique . Le pH final de ce milieu est de 6,5. Le milieu est ensuite stérilisé par autoclavage durant 15 min à 1 bar. C’est un milieu sélectif, milieu d’isolement spécifique pour les bactéries lactiques. Matériels et méthodes III. Identification phénotypique Les souches ont été caractérisées par quelques tests classiques tels que : 1. Test de la catalase C’est un test fondamental pour orienter l’identification des coques et bacilles à Gram+. Le test catalase permet une première orientation dans la classification d’une souche bactérienne pure. Les BL isolées à partir des deux lots d’échantillonnage et ayant une activité inhibitrice sont testées pour la production ou non de la catalase. Ce test est réalisé comme suit : une goutte de peroxyde d’hydrogène (H2O2) à 3% (v/v) est ajoutée sur une colonie placée sur une lame de microscope. La réaction est dite positive lorsqu’une effervescence est observée. 1. Test de l’oxydase : Ce test est à la base de l’identification des bactéries Gram - ; il est l’un des critères les plus discriminatifs et les plus employés pour l’identification des bactéries, surtout des bacilles. Le test est effectué comme suit : la colonie pure prise du milieu gélosé qui est le MRS est mise sur papier watman imprégné de réactif de l’oxydase (N-tétramétyl-1,4 phénylènediamine). Les bactéries produisent l’enzyme oxydent ce réactif pour former un composé violet, l’indophénol, la suspension devient alors violette après 20 à 60 secondes. 2. Coloration du Gram : La coloration du Gram est la coloration la plus utilisé en bactériologie, permettant de mettre en évidence les propriétés de la paroi bactérienne et d’utiliser ces propriétés pour distinguer et classifier les bactéries. Matériels et méthodes La coloration a été faite comme suit : après avoir déposé une goutte d’eau sur une lame de verre, on prélève une colonie à l’aide d’une pipette pasteur ; ensuite on fait dissocier soigneusement l’inoculum dans la goutte d’eau et la laisser sécher puis on procède à la fixation du frottis soit avec l’éthanol à 90°C (5 min) puis on enflamme la lame ou on passe directement 3 fois la lame dans la flamme du bec bunsen. La coloration au violet de Gentiane (coloration basique) : la lame est plongée pendant 2 à 3 min dans la coloration au violet de gentiane, toutes les bactéries sont colorées en violet puis rincer à l’eau déminéralisée. En suite, la décoloration à l’alcool : verser goutte à goutte l’alcool sur la lame inclinée obliquement, surveiller la décoloration (5 à 10 secondes) l’alcool pénètre dans la bactérie. La coloration au violet de Gentiane disparait. Les bactéries décolorées sont des bactéries Gram négatifs. Si l'alcool ne traverse pas la paroi, on est en présence de bactéries Gram positifs. Une contre coloration avec la Fushine ou de la Safranine : laisser agir de 30 secondes à 1 minute puis laver doucement à l’eau déminéralisée. Les bactéries Gram négatif sont colorées en rose. Matériels et méthodes Figure 4 : les étapes de la coloration de Gram Matériels et méthodes Figure 5 : la lame après la coloration du Gram. 2. Confirmation moléculaire des souches obtenues : *Extraction de l’ADN : Deux méthodes d’extraction de l’ADN génomique bactérien ont été utilisées et testées au cours du stage qui sont l’extraction par choc thermique et l’extraction par kit. 1. L’extraction par choc thermique : On va prendre quelques colonies bactériennes de chaque souches pure cultivée sur gélose MRS ont été prélevées à l’aide d’une anse et suspendues dans 1 ml d’eau distillée stérile. Les tubes sont ensuite centrifugés à 8000 rpm pendants 5 minutes à 20°C. Le surnageant de chaque culture a été soigneusement éliminé et le culot cellulaire a été lavé du nouveau par 1 ml d’eau distillée stérile. Les échantillons ont été ensuite portés à l’ébullition dans un bain marie à 100 °C pendant 3 minutes et puis rapidement transférés et incuber sur la glace pendant 3 minutes. Après centrifugation à 1200 rpm pendant 5 minute, 100µl du surnageant ont été récupérés à l’aide d’une micropipette et mise dans un nouveau eppendorf stérile. L’extraction par choc thermique (par détaillée) L’extraction de l’ADN par choc thermique soit à partir de bouillon de MRS ou par les boites qui contiennent les colonies, elle est comme suit : *à partir des boites de pétri : on va prendre 1ml d’eau distillé + des colonies qui se trouve dans les boites de pétri. *on va faire la centrifugation en 13000 rpm pendant 7 minutes. *rejeter le surnageant de volume 800 µl. Matériels et méthodes *récupérer le culot de volume 200 µl. * chauffage par ébullition 100 °C pendant 5 min pour le but de fragiliser la membrane bactérienne. *mettre directe dans le glace puis mettre directe dans – 20 °C dans le congélateur (cette étape reste 5 min). *Centrifuger une autre fois 13000 rpm pendant 5 min. * récupérer le surnageant de 100 ul. *récupérer dans le congélateur. 2. Extractions par kit : C’est une autre méthode dans le but d’extraire l’ADN : A partir du bouillon d’enrichissement les bactéries ont été récoltées par centrifugation à 8000 rpm pendant 5min. Ensuite, le culot bactérien a été mis en suspension dans 200 µl de tampon TE (50 mM Tris, EDTA, PH 8,0) plus de 400 µl de la solution digestion et 3µl de la protéinase K (20 mg / ml ) et incubé 5 min à 55°C . Le culot d’ADN a été ensuite lavé avec 260µl de l’éthanol à 100 % puis la mixture préparée à été placée dans des tubes de collection. Une centrifugation répétée deux fois à 1000 rpm pendant 2 min a été réalisée. Les tubes de collection ont été par la suite placés dans des tubes eppendorf et 50 µl du tampon d’élution ont été ajoutés au centre de la membrane de chaque tube de collection, et les tubes ont été incubés à 37°C pendant 2 min. Une dernière centrifugation à 1000 rpm durant 2 min à été faite pour la récupération de l’ADN extrait. 3. Identification des souches bactériennes par l’amplification du gène par réaction de polymérisation en chaine : Matériels et méthodes La technique d’amplification génique in vitro ou PCR (polymerease chain reaction) consiste en une multiplication exponentielle d’un fragment d’acide nucléique dont la taille est généralement comprise entre 200 et 300 paires de base. Cette technique utilise une ADN polymérase particulière .dénommée polymérase taq, issue d’une bactérie (Thermophilus aquaticus) vivant dans des sources d’eau chaude, cette uploads/Geographie/ ichrak-materiels.pdf