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HAL Id: hal-02010604 https://hal.univ-lorraine.fr/hal-02010604 Submitted on 7 Feb 2019 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Détection de gènes de résistance aux antibiotiques dans les bactéries isolées des produits de la mer Emilie Dauvergne To cite this version: Emilie Dauvergne. Détection de gènes de résistance aux antibiotiques dans les bactéries isolées des produits de la mer. Microbiologie et Parasitologie. 2018. hal-02010604 AVERTISSEMENT Ce document est le fruit d'un long travail approuvé par le jury de soutenance et mis à disposition de l'ensemble de la communauté universitaire élargie. Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de référencement lors de l’utilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pénale. Contact : ddoc-memoires-contact@univ-lorraine.fr LIENS Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10 http://www.cfcopies.com/V2/leg/leg_droi.php http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm ANNEE UNIVERSITAIRE 2017-2018 Détection de gènes de résistance aux antibiotiques dans les bactéries isolées des produits de la mer Par Emilie Dauvergne UNIVERSITE DE LORRAINE (Faculté des Sciences et Techniques-Université Henri Poincaré) Master 2 BioMANE (Biotechnologies Microbiologie Aliment Nutrition et Environnement) Mention Microbiologie Environnementale et sanitaire Lieu et dates du stage : Agence nationale de sécurité sanitaire en charge de l’Alimentation, de l’Environnement et du Travail (Anses) ; laboratoire de Sécurité des Aliments ; Plateforme IdentyPath (IDPA). Du 1 Février au 31 Juillet 2018. 14 rue Pierre et Marie Curie ; 94701 Maisons-Alfort Cedex Maîtres de Stage : Anne Brisabois, Chef du département Produits de la pêche et de l’aquaculture ; Patrick Fach, Responsable de la plateforme IdentyPath (IDPA) Encadrante : Sabine Delannoy, chargée de projet microbiologie (IDPA) Tuteurs pédagogiques : Pierre Leblond, Frédéric Jorand REMERCIEMENTS Je tiens tout d’abord à remercier Laurent Laloux, directeur du Laboratoire de sécurité des aliments pour m’avoir accueilli dans son établissement. Je tiens également à remercier Anne Brisabois et Patrick Fach, mes maîtres de stage qui m’ont apporté leurs avis et leur soutien durant ce stage et qui se sont toujours montrés disponibles et à l’écoute de mes interrogations. Je remercie particulièrement Sabine Delannoy pour tous ses conseils, ses remarques pertinentes, sa patience, sa transmission d’expérience technique sur les tests in silico ainsi que les manipulations effectuées en laboratoire et qui m’a encadré sur la durée du stage sur le site de Maisons-Alfort; Sophie Granier pour toutes ses expériences, anecdotes passionnantes, amusantes, son savoir sur l’antibiorésistance et son expertise qui a été nécessaire sur le projet AMR Chip; Hattie Webb pour sa patience et ses conseils sur les manipulations de laboratoire ainsi que son aide et son savoir quant aux gènes de résistance aux antibiotiques. Je tiens à remercier Graziella Bourdin, Arnaud Briet, et Sarah Leclerq de l’unité B3PA de Boulogne-Sur-Mer pour leurs avis et leur aide au projet AMR Chip au travers de réunions et de l’apport d’informations recueillies sur la collection des souches isolées des produits de la mer. Je remercie tous les laboratoires qui ont acceptés de collaborer sur ce projet par l’envoi de contrôles positifs nécessaires pour la réalisation de la puce. Je tiens également à remercier Nathalie Dallet et Nathalie Bongoua pour l’aspect administratif et pour leur accueil au sein de l’ANSES durant ce stage. Je remercie enfin tous mes collègues de l’open-space pour leur humour, leur bonne humeur, leur esprit d’équipe et la motivation toujours au rendez-vous. Sommaire INTRODUCTION ................................................................................................................................... 1 1. Présentation de l’Anses et de ses laboratoires ................................................................................. 1 1.1 Présentation du laboratoire de sécurité des aliments ..................................................................... 1 1.1.1 Présentation de la plateforme IdentyPath (IDPA) ........................................................... 1 2. Contexte de l’étude .............................................................................................................................. 3 2.1 L’Antibiorésistance ....................................................................................................................... 3 2.1.1 Antibiotiques et mécanismes d’action .................................................................................... 3 2.1.2 Mécanismes de résistance aux antibiotiques .......................................................................... 4 2.1.3 Diffusion de la résistance ....................................................................................................... 6 2.2 L’Antibiorésistance bactérienne : un enjeu majeur en santé publique .......................................... 7 2.2.1 Conséquences de l’antibiorésistance bactérienne ................................................................... 7 2.2.2 Classes d’antibiotiques d’importance critiques en santé humaine ......................................... 8 2.2.3 Les systèmes de surveillance .................................................................................................. 8 3. Les produits de la mer, source potentielle de bactéries résistantes aux antibiotiques ......................... 9 3.1 Surveillance et produits de la mer ................................................................................................. 9 3.2 Milieu aquatique et transferts ........................................................................................................ 9 3.3 Détection de gènes de résistance aux antibiotiques dans les bactéries isolées des produits de la mer ..................................................................................................................................................... 10 MATERIEL ET METHODE ................................................................................................................ 11 1. Collections de souches étudiées ........................................................................................................ 11 1.1 Contrôles positifs ......................................................................................................................... 11 1.2 Extractions des contrôles positifs ................................................................................................ 12 1.3. Collection des souches « terrains » isolées des produits de la mer de Boulogne-Sur-Mer (Collection B3PA) ............................................................................................................................. 12 3. PCR temps réel .................................................................................................................................. 13 3.1 Principe Technique de PCR temps réel ....................................................................................... 13 3.2 Principe de la PCR temps-réel très haut débit Fluidigm ............................................................. 14 3.3 Protocole décrit ............................................................................................................................ 14 4. Choix des cibles................................................................................................................................. 15 4.1 Gènes de résistance aux antibiotiques ......................................................................................... 15 4.2 Marqueurs d’éléments génétiques mobiles ................................................................................. 16 4.3 Dessins des amorces et tests in silico .......................................................................................... 17 RESULTATS ........................................................................................................................................ 19 1. Dessin des marqueurs de gènes d’antibiorésistance ...................................................................... 19 2. Validation de la Puce Fluidigm ..................................................................................................... 22 3. Recherche de marqueurs de résistance dans la collection de souches B3PA ................................ 26 DISCUSSION ....................................................................................................................................... 27 1. Spécificité de l’outil de détection développé ................................................................................. 27 2. Spécificité diagnostique des couples d’amorces lors de la validation de la puce Fluidigm .............. 27 3. Marqueurs non validés ...................................................................................................................... 29 4. Marqueurs d’Antibiorésistance détectés dans la collection B3PA .................................................... 30 5. Limites de l’outil de détection utilisé ................................................................................................ 32 CONCLUSION ..................................................................................................................................... 33 BIBLIOGRAPHIE .................................................................................................................................. 1 WEBOGRAPHIE .................................................................................................................................... 6 ANNEXE 1 : Organigrammes de l’ANSES et du LSAl ......................................................................... 7 ANNEXE 2 : Collection B3PA ............................................................................................................... 9 Liste des figures Figure 1: Outils de la plateforme IdentyPath (extrait de Bulletin épidémiologique, santé animale et alimentation n°68/Spécial Vigilance sur chaîne alimentaire).................................................................. 2 Figure 2: Cibles d'antibiotiques à différents niveaux de la cellule (extrait de Biology of Micro- organisms, 11ème édition, 2006)............................................................................................................. 3 Figure 3: Principaux mécanismes de résistance bactériens aux antibiotiques (extrait de la Recherche, n°314, Novembre 1998) .......................................................................................................................... 5 Figure 4: Carte du plasmide pBlueScriptIISK(+) avec insert mcr-7 ..................................................... 11 Figure 5: Collection B3PA (Annexe2) .................................................................................................. 13 Figure 6: Principe de l'intercalant SybrGreen vs EvaGreen (Extrait de Sun et al, 2016) ...................... 14 Figure 7: Plan de chargement de la puce 96x96. ................................................................................... 15 Figure 8: Paramètres de la PCR temps réel utilisés ............................................................................... 15 Figure 9: Schéma du protocole utilisé pour les tests in silico. .............................................................. 18 Figure 10: Détection du gène blaTEM (PCR temps réel, EvaGreen) ...................................................... 23 Figure 11: Détection du gène qnrB (PCR temps réel, EvaGreen) ......................................................... 23 Figure 12: Résultats bruts d’amplification avant l’application des filtres (Ct et Tm) ........................... 27 Figure 13 : Technique de CIM (Carbapenem inactivation method) (extrait de van der Zwaluw K et al, 2015) ...................................................................................................................................................... 28 Figure 14: Principe du séquençage de nouvelle génération (NGS) Illumina (extrait de https://emea.illumina.com) .................................................................................................................... 29 Figure 15: Résultat du blast de la séquence FosA4 chez Morganella. .................................................. 30 Figure 16: Expansion du gène blaNDM à travers le monde (Extrait de Normann et Poirel, 2014) ......... 31 Liste des tableaux Tableau 1: Antibiorésistance bactérienne associée aux classes d’intégrons. (Extrait de Génétique bactérienne IV : Les intégrons - Faculté de Médecine de Limoges. 2002 .............................................. 7 Tableau 2: Gènes de résistance aux antibiotiques ciblés. ...................................................................... 16 Tableau 3: Gènes de résistance aux antibiotiques ciblés. ...................................................................... 21 Tableau 4 : Gènes signature d’éléments génétiques mobiles ciblés. ..................................................... 22 Tableau 5: Liste des couples d'amorces validés à 100% au niveau de la sensibilité et spécificité diagnostiques ......................................................................................................................................... 24 Tableau 6: Liste des couples d’amorces pour lesquels la sensibilité diagnostique est de 100% mais dont la spécificité diagnostique n’a pas pu être déterminée. ................................................................. 24 Tableau 7: Liste des couples d’amorces validés pour la sensibilité diagnostique mais dont la spécificité est moins bonne que prévue. ................................................................................................................. 25 Tableau 8: Liste des couples d’amorces non validés (en raison de la présence de faux positifs) ......... 25 Tableau 9: Liste des couples d’amorces non validés. ............................................................................ 25 Tableau 10: Liste des couples d’amorces en attente de validation ........................................................ 25 Tableau 11: Résultats de détection des gènes cibles dans la collection B3PA ...................................... 26 ABREVIATIONS ADN : Acide Désoxyribonucléique Anses : Agence nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail ARG-ANNOT : base de données, annotation de gènes de résistance aux antibiotiques ARNr : Acide ribonucléique ribosomale ARNt : Acide ribonucléique de transfert ATBR : Antibiorésistance BacMet : Base de données de gènes de résistance aux biocides antibactériens et métaux BLSE : bêta-lactamases à spectre élargi B3PA : L’unité Bactériologie et Parasitologie des Produits de la Pêche et de l'Aquaculture CARD : Base de données, résistance aux uploads/Geographie/ bus-m-2018-dauvergne-emilie 1 .pdf