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page 1 Evaluation de la méthode ISO 6579 de détection de Salmonella spp. (Sur la base de l'intervention de Mme BOHNERT – AFSSA - lors de l'Assemblée générale 2001 de CECALAIT) a méthode décrite dans le projet de norme ISO 6579 (2000) de recherche de Salmonella spp. dans les aliments a été évaluée, dans le cadre d’un programme européen destiné à établir, au moyen d’études collaboratives, les performances de fidélité des méthodes ISO de détection et/ou dénombrement de microorganismes pathogènes dans les aliments. En outre, dans le but d’arriver à la validation de cette méthode auprès des autorités américaines, elle a été comparée aux deux méthodes utilisées par l’AOAC International, pour, respectivement, les aliments fortement contaminés et faiblement contaminés, à savoir, AOACI OMA 995.20 et AOACI OMA 2000.06. Ces méthodes ont été trouvées globalement satisfaisantes, avec des performances de fidélité équivalentes quel que soit l’aliment testé, la détection de S. Typhi et Paratyphi pouvant toutefois se révéler délicate. A l’issue de ces travaux, il a été recommandé de reconnaître la méthode ISO aux Etats-Unis et d’inclure en annexe de la future norme ISO les valeurs de fidélité obtenues au cours de cette étude. n 1996, la Commission Européenne lançait un projet, destiné à évaluer la fidélité de six méthodes microbiologiques horizontales ISO, portant sur la détection et / ou le dénombrement de microorganismes pathogènes dans les aliments. Des données de fidélité, établies par une étude collaborative, conformément à la norme ISO 5725, sont en effet, un préalable indispensable avant l’adoption d’une méthode normalisée en tant que norme Européenne par le CEN (Comité Européen de Normalisation). Elles ont d’ores et déjà été obtenues pour Bacillus cereus, Listeria monocytogenes (recherche et dénombrement), Staphylococcus à coagulase positive et Clostridium perfringens (cf Lettres de CECALAIT n° 26, 30, 35 et 36). L’ultime étape avant l’achèvement du projet était l’évaluation de la méthode de recherche de Salmonella spp. Or celle-ci est décrite dans le norme ISO 6579, dont la dernière édition datait de 1993 et qui fait l’objet d’une procédure de révision depuis 1997. Il semblait logique d’attendre que cette procédure ait avancé significativement, afin d’évaluer de préférence, la méthode destinée à être appliquée dans les années à venir. C’est pourquoi la méthode de détection de Salmonella spp. a été évaluée en dernier, en suivant le protocole expérimental décrit dans le projet EN ISO 6579, paru en 2000. Les programmes de validation précédents avaient impliqué une vingtaine de laboratoires internationaux, au sein de l’Union Européenne. Cette fois-ci, le projet a encore pris plus d’ampleur, avec la participation d’experts américains de l’AOAC International. Ce, dans le but de constituer auprès de cet organisme un dossier de validation de la méthode ISO 6579 afin qu’elle soit reconnue aux Etats-Unis et puisse, en conséquence, être autorisée dans les contrôles à l’exportation vers les Etats-Unis, à la place de la méthode AOAC. La procédure s’en est évidemment trouvée alourdie puisqu ’impliquant la comparaison des deux méthodes. Comme précédemment, les coordinateur et partenaires du programme restent: : y coordinateur de l’ensemble du projet : AFSSA (Mme LAHELLEC) y partenaires : le RIVM aux Pays-Bas et le MAFF-CSL au Royaume Uni A tour de rôle, chacun de ces trois laboratoires a été responsable d’un volet du projet. L’étude sur Salmonella spp. a ainsi été conduite par l’AFSSA (unité de Ploufragan) en Europe ; un laboratoire américain (BioControl Systems) supervisant l’étude aux Etats-Unis. Parmi les sous-contractants de ce programme, CECALAIT a assuré la préparation, la mise au point, la définition des paramètres de conservation et l’expédition des échantillons de fromage. 1) S ALMONELLA : GENERALITES ET REGLEMENTATION ª GENERALITES Il s’agit de germes incriminés dans de très nombreuses toxi- infections alimentaires collectives (TIAC), plus de 40 000 cas annuels aux Etats-Unis, dont la fréquence semble de plus augmenter de façon notable, principalement aux Etats-Unis, mais aussi dans les autres pays développés. Dans l’environnement, de nombreuses espèces de salmonelles sont naturellement présentes chez les poulets, dindes, canards, rongeurs, chats. On les trouve aussi dans l’eau, le sol, mais également sur les surfaces industrielles ou de cuisines. Les aliments les plus fréquemment incriminés dans les infections sont des viandes hachées, de la charcuterie, de la volaille, des rôtis de boeuf préparés à l'avance et des oeufs (ovoproduits, crème pâtissière, mayonnaise, crème glacée), du poisson et des coquillages. Les statistiques de l’Ivs concernant les TIAC de ces dernières années en France montrent que le lait et les produits laitiers sont plus rarement en cause. Cependant, l’actualité récente, de même que l’historique global des TIAC, en France et à travers le monde, montrent qu’ils sont également concernés. De façon générale, le nombre de salmonelloses s’accroît pendant les mois d’été, simplement parce que ces germes se développent facilement et rapidement dans les aliments non réfrigérés (ex. pique-niques). Les Salmonella sont des bâtonnets Gram négatif, mobiles (à l’exception d’un sérovar : Gallinarum-Pullorum plus spécialement pathogène des oiseaux), aéro-anaérobies facultatifs, non-sporulés. Leur température optimale de croissance est de 35/37°C ; elles L E page 2 peuvent cependant se multiplier à des températures allant de 5°C jusqu’aux alentours de 45/47°C pour certaines, bien que leur croissance soit nettement retardée par les températures inférieures à 10°C. La congélation ne garantit pas leur disparition complète. Elles sont en revanche détruites par la pasteurisation. Au point de vue pH, elles supportent généralement une gamme de pH allant de 4,5 à 9,0 avec un optimum de 6,5 à 7,5 mais la persistance de certaines souches dans des environnements fortement acides a déjà été signalée. Elles sont, en outre, capables de survivre très longtemps dans des aliments déshydratés. Enfin, on a signalé l’existence d’au moins une souche résistant à plusieurs antibiotiques de nature différente. Les salmonelles sont toutes potentiellement pathogènes pour l'espèce humaine ou tous les animaux. Salmonella Typhi et Paratyphi, même ingérés à faible dose, sont responsables des fièvres typhoïde ou paratyphoïde dans l’espèce humaine (taux de mortalité : 10%). Les autres formes, moins graves, de salmonelloses nécessitent généralement l’ingestion d’un nombre élevé de microorganismes. Puis la multiplication des germes dans le tube digestif produit des symptômes en 6 à 48h. Il s’agit de douleurs abdominales souvent violentes, de vomissement fréquents, douloureux et violents, accompagnés de diarrhées, nausées, céphalées, fièvre, frissons, abattement… qui durent de 1 à 7 jours. La guérison est généralement sans complication, mais la FDA recense environ 2 cas de mortalité pour 1000 contaminations. Les sujets les plus sévèrement atteints sont en général, les personnes âgées, les très jeunes enfants, les personnes immunodéprimées. ª REGLEMENTATION Les règlementations française et communautaire imposent l’absence de Salmonella pour la quasi totalité des aliments. C’est notamment le cas pour les laits, lait en poudre, fromages, beurres, produits liquides à base de lait, lors de leur mise sur le marché. Dans le détail, la directive 92/46* communautaire spécifie « absence dans 25g pour le lait cru destiné à la consommation humaine directe, dans 1g pour les autres produits ** ». Initialement reprises dans la réglementation française (AM du 30/4/1994), ces spécifications ont été modifiées par une note de service de la DGAl (n°2686 du 24/10/1996 ***) qui fixe « absence dans 25g » pour l’ensemble des produits laitiers. * citée dans DG 24, «’aperçu des critères microbiologiques pour les denrées alimentaires dans la législation communautaire en vigueur, 20/09/2001 ** in directive 94/71 du 13/12/1994 modifiant la directive 92/46 *** citée dans la Note de service n°2001-8090 du 27/06/2001 2) METHODES DE DETECTION ª EN 12824 DE 1998 C’est actuellement la méthode horizontale de référence en France et dans l’Union Européenne pour la recherche des Salmonella spp. Elle se base sur la norme ISO 6579 :1993, notamment en imposant : y l’utilisation des milieux sélectifs liquides suivants : bouillon de Rappaport-Vassiliadis vert malachite chlorure de magnésium et bouillon au sélénite-cystine, pour la phase d’enrichissement, y l’utilisation de la gélose au rouge de phénol et au vert brillant (milieu d’Edel et Kampelmacher) et d’une autre gélose au choix, pour la phase d’isolement. Elle s’en distingue cependant en introduisant quelques modalités spécifiques de pré-enrichissement pour certains produits alimentaires et en laissant la possibilité de 24h supplémentaires d’incubation dans le milieu de Rappaport-Vassiliadiis. ª PROJET ISO 6579, JUIN 2000 C’est la méthode décrite dans ce projet qui a été évaluée dans le cadre de cette étude. Elle diffère très nettement des méthodes décrites dans la version 1993 de la norme et dans la norme EN 12824. Les différences portent notamment sur : y les deux milieux sélectifs liquides pour l’enrichissement : pour le premier, bouillon de Rappaport-Vassiliadis, c’est la formulation contenant de la peptone de soja qui est désormais retenue (RVS) ; le deuxième milieu, bouillon au sélénite-cystine, jugé trop toxique pour l’environnement, est remplacé par le bouillon Mueller-Kaufmann au tétrathionate-novobiocine (MKTTn) y les deux milieux sélectifs solides pour l’isolement : comme avant, l’un est obligatoire, l’autre est laissé au libre choix du laboratoire. Mais, la gélose au rouge de phénol et au vert brillant autrefois obligatoire est maintenant remplacée par la gélose xylose lysine désoxycholate (XLD). Quant au deuxième milieu, laissé au choix, il doit permettre la recherche des uploads/Geographie/ lettre-24-1523000910.pdf