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IV.4.3Conservation des champignons Les isolats fongiques purs sont conservés po

IV.4.3Conservation des champignons Les isolats fongiques purs sont conservés pour : une courte durée ou une longue durée IV.5 Identification moléculaire des isolats sélectionnés Six isolats fongiques ont été sélectionnés pour l‘analyse moléculaire IV.5.1Extraction d’ADN fongique L'ADN a été extrait des mycéliums fongiques par l‘utilisation du kit Qiagen Dneasy mini Plant en suivant le protocole du fabriquant (QIAGEN, Hilden, Germany). IV.5.2Amplification d’ADN Les régions ITS (internally transcribed spacer) de l‘ADNr nucléaire ont été amplifiées par PCR à l‘aide du couple d‘amorces spécifique des champignons ITS1/ITS4 ITS 1(5‘- TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3‘) ITS 4 (5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘) Les cycles de réactions de PCR se composent de 3 phases principales : la dénaturation de l‘ADN, l‘hybridation et l‘élongation. Les cycles sont programmés dans le thermocycleur . Les produits d‘amplification ont été révélés après une électrophorèse. Après migration, l‘ADN a été visualisé et photographié sous UV. IV.5.3 Séquençage Le séquençage automatisé du fragment ITS de l‘ADN ribosomale est réalisé selon la technique de Sanger (GATC biotech, Germany). IV.5.4 Analyse phylogénétique Les séquences ont été alignées en utilisant le software disponible MUSCLE. L'histoire évolutive a été déduite en utilisant la méthode de Maximum Likelihood et Tamura 3- parameter model. IV.6 Tests préliminaire pour la biodégradation des hydrocarbures pétroliers IV.6.1 Test de l’indicateur redox 2,6-dichlorophénol indophénol (DCPIP) La capacité des champignons isolés à dégrader le pétrole, le diesel et l‘huile de moteur usagée a été initialement examinée selon la technique modifiée de Hanson et al. (1993), basé sur l'indicateur redox 2,6 dichlorophénol indophénol (DCPIP). Le milieu minéral Bushnell-Haas (BH) a été utilisé pour le test de sélection qui consiste en: MgSO4 (0,2 g/l), CaCl2 (0,02 g/l), KH2PO4 (1 g/l), K2HPO4 (1 g/l), NH4NO3 (1 g/l) et FeCl2 (0,05 g/l), eau distillée (1000 ml), pH 7,0 Figure 19. Test de dégradation des hydrocarbures par l‘indicateur redox DCPIP IV.6.2 Test de dégradation utilisant un milieu spécifique Les isolats fongiques sont transférés dans un milieu spécifique pour la croissance des champignons adaptés aux hydrocarbures (hydrocarbon-adapted fungi « HAF ») selon Oudot et al. (1993). Le milieu est composé de : KC1 (0,25 g/l); NaH2PO4 (1 g/l); MgSO4 (0,5 g/l); NO3NH4 (1 g/l); eau distillée (1000 ml). Chaque isolat est cultivé dans des tubes (20x200 mm) qui contiennent 20 ml du milieu HAF et 0.1 ml de pétrole, diesel ou l‘huile usagée. Figure 20. Protocole de dégradation des hydrocarbures en milieu HAF Les isolats fongiques qui montrent une croissance visible de mycélium ou d'hyphes et/ou une sporulation sont évalués comme potentiellement capables d'utiliser les hydrocarbures pétroliers comme source de carbone et d'énergie IV.7 Etude quantitative de la biodégradation des hydrocarbures IV.7.1Test de biodégradation des hydrocarbures en milieu liquide La mesure du pourcentage de dégradation de chacun des trois huiles pétrolières a été réalisée en milieu BH liquide. L‘expérimentation est faite dans des flacons de 250ml contenant 100 ml de milieu BH liquide (pH = 7) et 2% (v/v) de pétrole brut ou de diesel, et 50 ml de BH avec 1% (v/v) d'huile usagée comme seule source de carbone, séparément. Des explants de mycélium (trois disques de 8 mm Ø) prélevés sur les bords d'une culture active sur PDA ont été inoculés dans chaque fiole. Ensuite, les cultures ont été incubées à 30 °C pendant 40 jours. Des fioles du milieu BH contenant chaque hydrocarbure sans inoculum sont préparées comme témoins qui permettent de quantifier l‘évaporation et de mesurer la biodégradation. Tous les tests ont été réalisés en triplicata. IV.7.1.1 Extraction des hydrocarbures et analyse gravimétrique En fin de culture, les produits pétroliers résiduels sont récupérés par extraction liquide- liquide. Le pourcentage des hydrocarbures totaux dégradés a été déterminé à partir de la formule suivante % degradation = a − b × 100 a a : poids du pétrole, diesel ou l‘huile usagée résiduel dans le témoin, b : poids du pétrole, diesel ou l‘huile usagée résiduel dans la culture. IV.7.1.2Détermination de la biomasse fongique Après l‘extraction des hydrocarbures résiduels, la phase aqueuse contenant la biomasse fongique a été filtrée par un papier filtre (Whatman N °1). La masse fongique récupérée est séchée à 70 °C jusqu'à un poids constant. IV.7.1.3Détermination du pH final de la culture Le pH du milieu de culture est mesuré à la fin du temps de l‘expérience pour l‘ensemble des répétitions et pour les témoins par une sonde de pH-mètre Figure 21. Les étapes de l‘étude quantitative de la dégradation du pétrole 8 7 8 7 6 5 4 3 2 1 0 6 5 4 3 2 1 0 -1 PB2 (pétrole résiduel) PB2 (biomasse) HM3 (pétrole résiduel) HM3 (biomasse) HM4 (pétrole résiduel) HM4 (biomasse) S2.2 (pétrole résiduel) S2.2 (biomasse) 01020304050 Temps (jours) Résultats et discussion V.6 Etude de la cinétique de biodégradation des hydrocarbures en milieu liquide Afin d‘améliorer nos informations sur le mécanisme de dégradation fongique des hydrocarbures pétroliers, une estimation des quantités d‘hydrocarbures totaux dégradés et de biomasse accumulée au fil du temps a été réalisée. Les isolats PB2, HM3, HM4 et S2.2 ont été sélectionnés pour le suivi de la biodégradation du pétrole en fonction du temps (figure 41). La biodégradation du diesel au fil du temps a été étudiée chez les isolats HM1, HM3, DSL1 et S2.2 (figure 42). La cinétique de biodégradation de l‘huile usagée a été étudiée chez PB2 et HM3 (figure 43). Figure 41. Concentration de pétrole et biomasse fongique accumulée dans le milieu BH pendant la période d‘incubation Une réduction rapide du pétrole a été observée au cours des 20 premiers jours d‘incubation par les souches testées, la souche S2.2 (A. fumigatus) a été la plus rapide dans la dégradation du pétrole en éliminant 43.03 % de pétrole durant les premiers 10 jours d‘incubation Pétrole résiduel Biomasse accumulée 16 3 14 2,5 12 10 2 8 1,5 6 1 4 2 0,5 0 0 HM1 (diesel résiduel) HM3 (diesel résid S2.2 (biomasse) 0 10 20 30 40 50 Temps (jours) Figure 42.Concentration de diesel et biomasse fongique accumulée dans le milieu BH pendant la période d‘incubation La vitesse de dégradation de diesel par les isolats sélectionnés a été moins rapide que celle de dégradation de pétrole HM3 a montré une dégradation rapide de diesel dans les 20 premiers jours conformément avec la constante de biodégradation de diesel la plus élevée (k= 0,023 / jour) et le t1/2 (30.14 jours) le plus court montré par cette souche. La vitesse de disparition de diesel par HM1 (P. chrysogenum) a été faible signifie que cette souche est besoin d‘une incubation plus lente pour qu‘elle dégrade une grande quantité d‘huile Diesel résiduel Biomasse accumulée 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 PB2 (huile usagée) HM3 (huile usagée) PB2 (biomasse) HM3 (biomasse) 01020304050 Temps (jours) Figure 43.Concentration de l‘huile usagée et biomasse fongique accumulée dans le milieu BH pendant la période d‘incubation De son tour, l‘huile usagée a été dégradée d‘une façon progressive et avec une vitesse constante et très faible par rapport au pétrole et au diesel par les deux isolats PB2 (A. terreus) et HM3 (A. ustus). Les constantes de biodégradation de l‘huile usagée étaient les plus faibles (0.006 et 0.007/ jour et les temps de demi vie enregistrés étaient les plus grand (99 et 115 jours, pour PB2 et HM3, respectivement) ceci indique que la dégradation de l‘huile usagée nécessite une durée d‘incubation plus longue avec ces isolats En général, les résultats présentés par les trois figures montrent une diminution progressive dans la quantité des hydrocarbures totaux accompagnée par une augmentation de biomasse fongique dans les milieux de culture liquides. Huile usagée résiduelle Biomasse accumulée uploads/Geographie/ materiels-et-methodes-partie-2.pdf