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J.P. Euzéby : Abrégé de Bactériologie Générale et Médicale à l'usage des étudia

J.P. Euzéby : Abrégé de Bactériologie Générale et Médicale à l'usage des étudiants de l'Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse (http://www.bacteriologie.net) Document destiné aux travaux pratiques de bactériologie Avertissement Ce document est destiné aux travaux pratiques de bactériologie des étudiants de l'École Nationale Vétérinaire de Toulouse. Il vient compléter l'enseignement théorique et l'enseignement oral dispensés aux cours des séances de travaux pratiques. L'enseignement pratique destiné aux futurs vétérinaires n'a pas pour vocation de les transformer en bactériologistes. Il a pour objectif de donner un aperçu sur les modalités du diagnostic bactériologique conventionnel afin de favoriser le dialogue entre les vétérinaires praticiens et les laboratoires de diagnostic. Le diagnostic moléculaire et le diagnostic immunologique sont abordés aux cours d'autres séances de travaux pratiques. Toutes les manipulations effectuées par les étudiants font préalablement l'objet d'une démonstration. Il serait hors sujet d'envisager tous les détails du diagnostic conventionnel, si bien que les quelques indications données ci-dessous sont limitées aux manipulations réalisées par les étudiants et elles sont simplifiées. Cette simplification peut conduire à quelques inexactitudes susceptibles de surprendre un bactériologiste. Toutefois, l'auteur espère que ces quelques approximations ne constituent pas des erreurs fondamentales. Des informations complémentaires peuvent être trouvées dans les ouvrages suivants : J. FRENEY, F. RENAUD, R. LECLERQ et P. RIEGEL : Précis de bactériologie clinique, 2ème éd., Editions ESKA, Paris, 2007, 1764 pages. Voir notamment le chapitre 4 (pages 67-108). N. MARCHAL, J.L. BOURDON et C. RICHARD : Les milieux de culture pour l'isolement et l'identification biochimique des bactéries. Doin éditeurs, Paris, 1982, 482 pages. Informations importantes Les séances de travaux pratiques débutent à 8h30 et elles ont lieu dans la salle de travaux pratiques de Microbiologie-Immunologie-Biologie moléculaire. Les étudiants doivent se munir d'une blouse en coton, d'une pince à mords plats (qui peut être remplacée par une pince à linge), d'un feutre capable d'écrire sur le verre et, si possible, d'un crayon gras. Déroulement des séances Jour 1 Remise d'un bouillon de culture contenant un mélange de deux bactéries. 1 Etat frais, coloration de Gram. Isolement sur une gélose trypticase-soja, une gélose Columbia au sang de mouton, une gélose BCP et une gélose de Mac Conkey. Jour 2 Observation des isolements, repérage des deux types de colonies. Coloration de Gram sur chaque type de colonies. Ensemencement d'une galerie d'identification pour l'une des deux bactéries. Jour 3 Lecture et interprétation de la galerie d'identification. Réalisation d'un antibiogramme. Jour 4 Lecture et interprétation de l'antibiogramme. Coloration de Ziehl sur un décalque d'organe. Précautions à prendre lors des manipulations Deux impératifs : Prévenir la contamination du manipulateur et de son entourage Eviter la contamination des milieux Mesures de sécurité contre la contamination du manipulateur et de son entourage Le bactériologiste est responsable de ses actes vis-à-vis de lui-même et de son entourage. Il doit respecter une discipline générale de travail, même si les bactéries étudiées au cours des travaux pratiques ne présentent pas un danger majeur. Avant de pénétrer dans la salle de travaux pratiques, le bactériologiste doit (i) déposer au vestiaire ses vêtements de ville tels que manteau, imperméable, veste ... ainsi que tous les objets personnels non indispensables à son travail et (ii) revêtir une blouse propre fermée sur le devant (les blouses en fibres synthétiques sont prohibées car elles sont inflammables et supportent mal l'ébullition et la javellisation). Il est interdit de manger, de boire ou de fumer dans un laboratoire de bactériologie ou dans la salle de travaux pratiques. En cours de travail, les mains peuvent être souillées. Aussi, on évitera de porter les mains au visage, de toucher des objets personnels (mouchoirs, sac, ...), de serrer la main d'un visiteur, etc. 2 Le lavage des mains doit être effectué au moindre soupçon de contamination. Après les manipulations il convient de nettoyer soigneusement les paillasses et de les désinfecter avec de l'eau de Javel. Une désinfection immédiate doit être effectuée en cas de projection de matière virulente ou lors de la casse accidentelle d'un récipient contenant un produit pathologique ou une culture bactérienne. Tout matériel en verre ayant été au contact avec une matière virulente doit être placé dans les bocaux contenant de l'eau de Javel. Mesures destinées à éviter la contamination des milieux Il est impératif de travailler dans le cône de stérilité d'un bec bunsen, sans parler et en évitant les courants d'air. Etat frais Déposer une goutte d'une culture en milieu liquide sur une lame de verre. Recouvrir la goutte d'une lamelle couvre objet (la culture ne doit pas déborder les contours de la lamelle). Luter la lame avec de la paraffine fondue. Observer immédiatement au microscope (objectif x40, condenseur non relevé au maximum, diaphragme non complètement ouvert). Après observation jeter immédiatement la lame dans un bocal contenant de l'eau de Javel Coloration de Gram (Kit Gram-Nicolle RAL) Voir aussi le fichier Principe de la coloration de Gram À partir d'une culture en milieu liquide Déposer une goutte de bouillon au centre d'une lame de verre, étaler la goutte et laisser sécher. Fixer par flambage à l'alcool à 95°. Recouvrir la lame de violet de gentiane phéniqué et laisser agir une minute. Rincer rapidement à l'eau du robinet et éliminer l'excès d'eau. Recouvrir la lame de lugol ("Liquide de lugol stabilisé PVP") et laisser agir une minute. Rincer à l'eau du robinet et éliminer l'excès d'eau. Différencier (décolorer) avec un mélange alcool -acétone ("Différenciateur rapide"). Ce temps est le plus délicat de la coloration de Gram (cf. démonstration réalisée au cours des travaux pratiques). Rincer abondamment à l'eau du robinet. Recouvrir la lame de fuchsine de Ziehl 1/10 et laisser agir une minute. 3 Rincer à l'eau du robinet. Sécher puis observer au microscope (objectif x100 à immersion). À partir d'une colonie Déposer une goutte d'eau sur une lame de verre. Prélever un fragment de colonie à l'aide d'une pipette Pasteur boutonnée. Dissocier soigneusement l'inoculum dans la goutte d'eau et laisser sécher. Fixer par flambage à l'alcool à 95°. Poursuivre la coloration comme indiquée ci-dessus. Coloration de Ziehl (Ziehl-Neelsen) Les lames remises aux étudiants (décalque d'organe) sont déjà fixées. Recouvrir la lame de Fuchsine de Ziehl. Chauffer jusqu'à émission de vapeurs blanches (voir démonstration effectuée lors des travaux pratiques). Laisser refroidir environ trois minutes. Répéter deux fois le chauffage si bien que dans un temps de l'ordre de 10 minutes la lame aura été chauffée trois fois. Rincer à l'eau du robinet. Recouvrir la lame d'acide sulfurique au 1/4 et laisser agir une minute. Rincer à l'eau du robinet. Recouvrir la lame d'alcool à 95° et laisser agir une minute. Rincer à l'eau du robinet. Recouvrir la lame avec une solution diluée de bleu de méthylène et laisser agir deux minutes. Rincer à l'eau du robinet. Sécher puis observer au microscope (objectif x100 à immersion). Milieux de culture utilisés au cours des travaux pratiques Pour une information générale concernant les milieux de culture, voir le fichier "Nutrition et croissance des bactéries (procaryotes)". Bouillon Trypticase- soja bioMérieux (composition en grammes par litre) : bio-Trypcase : 17 g/L bio-Soyase : 3 g/L Chlorure de sodium : 5 g/L Phosphate bipotassique : 2,5 g/L 4 Glucose : 2,5 g/L pH : 7,3 Le bouillon trypticase soja est un milieu largement utilisé et permettant la croissance de bactéries exigeantes. Gélose Trypticase-soja bioMérieux (composition en grammes par litre) : bio-Trypcase : 15 g/L bio-Soyase : 5 g/L Chlorure de sodium : 5 g/L Agar : 15 g/L pH : 7,3 La gélose trypticase-soja présente les mêmes avantages que le bouillon, mais elle permet de réaliser un isolement. Gélose Columbia + 5% sang de mouton bioMérieux bio-Polytone : 10 g/L Hydrolysat de protéines animales et végétales : 10 g/L bio-Myotone : 3 g/L Amidon de maïs : 1 g/L Chlorure de sodium : 5 g/L Agar : 13,5 Sang défibriné de mouton : 5% pH : 7,3 La gélose Columbia contient de l'amidon qui joue un rôle protecteur en neutralisant des substances toxiques contenues dans les milieux ou élaborées au cours de la culture. Outre son rôle nutritif, la présence de sang permet de visualiser des zones d'hémolyse qui sont particulièrement nettes sur ce milieu. Gélose de Mueller Hinton bioMérieux Infusion de viande bœuf : 300 g/L bio-Case : 17,5 g/L Amidon : 1,5 g/L Agar : 17 g/L pH : 7,3 La gélose de Mueller-Hinton est le milieu de référence pour l'étude de la sensibilité aux antibiotiques. Gélose BCP bioMérieux : Extrait de viande de bœuf : 3 g/L bio-Polytone : 5 g/L Lactose : 10 g/L 5 Agar : 10 g/L Bromocrésol pourpre : 25 mg/L Ce milieu permet la croissance des bactéries sans exigences particulières. La présence de lactose et d'un indicateur de pH permet de différencier les bactéries qui fermentent le lactose de celles qui ne le fermentent pas. Toutefois, ce milieu donne des résultats difficiles à interpréter lors de l'isolement de prélèvements polymicrobiens renfermant à la fois des bactéries lactose-positives et lactose-négatives. En effet, le virage de l'indicateur diffuse dans le milieu. De plus, une réalcalinisation rapide est observée lors d'une incubation supérieure à 18-24 heures. Les uploads/Geographie/ tp 2 .pdf