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Analyse microbiologique de l’eau Robinet et usées et stockage Sommaire I. Intro

Analyse microbiologique de l’eau Robinet et usées et stockage Sommaire I. Introduction …………………………………………………...... 2 II. But de TP…………………………………………………………2 III. Matériel utilisés…………………………………………………...3 IV . Protocol expérimental ……………………………………………4 V . Première jour ……………………………………………………4 1. Milieux de cultures utilisés…………………………………………………....4 2. Prélèvement d’eau et condition d’échantillonnage………………………….5 3. Préparation des dilutions……………………………………………………..5 4. La recherche de la flore mésophiles aérobies totales………………………..6 5. La recherche des Streptocoques………………………………………………6 6. La recherche des coliformes …………………………………………………6 VI. Deuxième jour…………………………………………………..7 1. Lecture et interprétations des résultats …………………………..7 1 Analyse microbiologique de l’eau Robinet et usées et stockage VII. Le troisième jour…………………………………………… ……..10 1. Dénombrement des colonies sur milieu TGEA…………………………10 2. Observation des bactéries à l’état frais …………………………………11 3. Coloration de Gram ………………………………………………………11 4. Test d’identification (TEST IMVC) ……………………………………...12 5. L ’ensemencement………………………………………………………. ...13 VIII. Quatrième jour ………………………………………………....14 Lecture et interprétation des résultats...........................................................15 IX. Conclusion ………………………………………….........16 Introduction Il est aujourd’hui évident que l’eau est essentielle à bien des égards. Disposer d’une eau potable et évacuer des eaux usées qui constituent des problèmes majeurs de l’hygiène urbaine mais aussi de la plupart des industries alimentaires. Les eaux destinées à l’alimentation humaine (boissons, préparation d’aliments etc.) ont des origines diverses (eaux souterraines ou de surface). La flore microbienne présente dans l’eau est très variée et dépend de l’origine de l’eau (eau de captage ou de distribution, eau résiduaire etc.). 2 Analyse microbiologique de l’eau Robinet et usées et stockage Parmi les principaux microorganismes susceptibles de se trouver dans l’eau on rencontre essentiellement des germes telluriques et des germes d’origine intestinale. Es que Le métabolisme peut identifie les microorganismes ? Le but de ce TP Dans ce TP qui déroule pendant quatre jours, on a suivi les analyse microbiologiques des eaux (potables, stockage et usées) afin de rechercher la présence ou l’absence des germes omniprésent dans l’eau telle que les germes aérobies, les coliformes surtout fécaux, les Streptocoques et les Staphylocoques. L’objectifs de ce TP est d’apprendre non seulement des notions théoriques mais aussi pour mieux pratiqué et manipuler dans un laboratoire de microbiologie. Matériels utilisés : 3 Analyse microbiologique de l’eau Robinet et usées et stockage Bec benzène les boites de pétri les flacons tube à essai Pipette graduée Pipette Pasteur les lames Bain marie Etuve microscope compteur de colonies Protocol expérimental : Première jour Milieux de cultures utilisés  Le Milieu TGEA : Pour le dénombrement de la flore mésophile aérobie totale (revivifiable). 4 Analyse microbiologique de l’eau Robinet et usées et stockage  Le Milieu Roth : C’est un milieu sélectif liquide pour la recherche de Streptocoques fécaux.  Le Milieu BCPL : C’est un milieu électif utilisé pour la détection et l’isolement des entérobactéries dans l’eau, il permet de faire une analyse présomptive.  Le milieu de Chapman est un milieu sélectif, utilisé pour les Staphylocoques. Milieu TGEA Milieu Chapman Milieu ROTH Milieu BCPL Prélèvement d’eau et condition d’échantillonnage : 5 Analyse microbiologique de l’eau Robinet et usées et stockage a. Prélèvement d’eau de stockage : A partir de bâche d’eau d’université on remplit un flacon stérile par l’eau. Préparation des dilutions : Pour l’eau de robinet et l’eau de stockage : ne réalise aucune dilution. Pour l’eau usée (catégories 1 et 2) : La technique se faite par dilution décimal successive de 10-1 jusqu’à 10-8à On prend 1ml de la solution mère (eau usée) et on le met dans un tube à 9 ml d’eau physiologique.( dilution 10- 1) puis on prend 1ml de dilution 10-1 et on le met dans un autre tube d’eau physiologie (dilution10-2) puis on prend 1ml de dilution 10-2 et on le met dans un autre tube d’eau physiologie (dilution 10-3) jusqu’à la dilution 10-8. La préparation des dilutions est effectuée dans des conditions aseptiques (à côté de bec benzène). 1)La recherche de la flore mésophiles aérobies totales : À partir des dilutions préparées de l’eau usée (10-4 ) On prend 2 fois 1ml de la dilution 10-4et on les met dans chacune de deux boite de pétri 1ml. On ajoute dans chaque boitte le milieu TGEA (ensemencement en profondeur) On Agite doucement par mouvement circulaire en forme de 8 pour assurer un mélange homogène de l’eau à analyser avec la gélose (milieu) et laisser refroidir sur la paillasse. On Incube les boites dans incubateurs à 37C° pendant 24 heurs Remarque : La même manipulation est réalisée pour les autres dilutions préparées. 6 Analyse microbiologique de l’eau Robinet et usées et stockage 2) La recherche des Streptocoques : Test présomptif : On utilise 2 tubes contenant milieu Roth (un tube à double concentration, et l’autre simple concentration) On a utilisée le flacon d’échantillon (solution mère de l’eau de stokage). On ajoute 1ml d’échantillon dans tube qui contient le milieu Roth simple concentration, et 10 ml d’échantillon dans le tube qui contient le milieu Roth à double concentration. On homogénéise les tubes Incubation des tubes dans une étuve à T° de 37°C pendant 24 heurs 3)La recherche des coliformes : Test présomptif : Avant l’ensemencement on doit vérifier s’il y a de l’air dans les cloches du durham pour le vider pour ne pas fausser nos résultats. On prendre 2 tubes de milieu BCPL (un tube double concentration, et l’autre simple concentration). On ajout 1ml d’échantillon (solution mère de l’eau de stokage) dans une tube qui contient de BCPL à simple concentration, et 10 ml d’échantillon dans le tube qui contient de BCPL à double concentration. On ferme et homogénéise les tubes. Incuber les tubes dans une étuve à une température de 37°C pendant 24h. 4)La recherche des Staphylocoques : 7 Analyse microbiologique de l’eau Robinet et usées et stockage On utilise le milieu de culture : Chapman. On met dans une boite de pétrie le milieu de Chapman. A l’aide d’une pipette graduée, on prélève 1ml (de solution mère d’eau de stokage) et puis on le verser sur le milieu (ensemencement en surface). Incuber les tubes dans une étuve à un températeur de 37°C pendant 24h. Le deuxième jour La première étape : Lecture et interprétations des résultats : Après l’incubation on retient nos boites et tubes de l’étuve pour voir s’il y’a une multiplication bactérienne : Sur le milieu BCPL : il n’y a pas changement de couleur vers le jaune ; et pas de production de gaz dans la cloche de Durham. Donc, le résultat est négative sur le milieu BCPL (pour les deux tubes) il n y a pas la capacité de dégradation de lactose en fermentation avec production co2 8 Analyse microbiologique de l’eau Robinet et usées et stockage Sur le milieu Roth : l’apparition d’un trouble, Donc, le résultat est positif sur le milieu Roth. (pour le tube DC) présence des streptocoques qui tolère l’azide de sodium Sur le milieu Chapman : présence des colonies La deuxième étape : A côté du bec benzène (dans la zone stérile), on met 15ml du milieu mac conkey dans une boite Pétri stérile, et on le laisse solidifier.  A partir d’un tube BCPL positif (de eau usé de dilution10-1) subit un virage de couleur du violé vers le jaune, avec une pipette graduée, on prend 1ml de ce denier et on ensemence en strie sur la boite Pétri du milieu mac conkey. Test de confirmation - pour les streptocoques : On prend un prélèvement d’un milieu Roth positif+ pour faire la coloration de gram. - pour les staphylocoques : On prend un prélèvement d’un milieu BCPL positif+ pour faire la coloration de gram. 9 Analyse microbiologique de l’eau Robinet et usées et stockage Coloration de Gram : A partir d'une colonie de milieu Routh(les colonies jaune), on réalise la coloration de Gram : On Dépose une goutte d'eau distillée sur une lame en verre. On Prélever un fragment de colonie à l'aide d'une pipette Pasteur. On Dissocie soigneusement l'inoculum dans la goutte d'eau et on laisser à sécher. On fait la fixation par le passage de lame 2 à 3 fois dans flamme bleu de bec benzène. A.Les étapes de coloration : On recouvrit la lame par le violet de gentiane pendant une minute. Rinçage rapidement à l'eau du robinet. On recouvrit la lame par lugol pendant minute. Rinçage à l'eau du robinet.  Décoloration avec l’alcool pendant 30 seconds. Rinçage à l’eau de robinet. On recouvrit la lame par fuchsine pendant une minute. Rinçage à l’eau du robinet. 10 Analyse microbiologique de l’eau Robinet et usées et stockage On sèche la lame pour l’observation microscopique Résultat De Coloration De Gram Troisièmes jour Première étape : 1. Dénombrement des colonies sur milieu TGEA : Après l’incubation on retient nos boites puis à l’aide d’un compteur de colonies on dénombre les colonies bactérienne apparaitre dans le milieu TGEA, le tableau ce dessous exprime les résultats de comptage de colonies. La moyenne de nombre de colonies = la somme de nombre de colonies de deux boite TGEA / 2 Dilution /l e nombre des colonies 10-1 1 0- 2 1 0- 3 1 0- 4 1 0- 5 1 0- 6 1 0- 7 1 0- 8 11 Ne sont pas des Staphylocoques sont des uploads/Geographie/introduction 8 .pdf