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Département de Microbiologie Cours Techniques de Contrôle Microbiologique http://cte.univ-setif.dz/moodle/mod/folder/view.php?id=19860 Réalisé par Haichour Nora Destiné aux étudiants de 3ème année « Microbiologie » 2019-2020 Université Ferhat Abbas Sétif 1 Faculté des Sciences de la Nature et De La Vie الجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية وزارة التعليم العالي والبحث العلمي ،جامعة فرحات عباس طيف س1 كلية علوم الطبيعة والحياة i Table des matières Table des matières.................................................................................................................................. i Listes des figures et des tableaux .......................................................................................................... ii Techniques de contrôle microbiologiques ............................................................................................ 1 1. Objectifs du contrôle microbiologique .............................................................................................. 1 1.1. Qualité hygiénique ..................................................................................................................... 1 1.2. Qualité marchande ..................................................................................................................... 1 2. Politique de contrôle ......................................................................................................................... 2 2.1. Les spécifications microbiologiques ........................................................................................... 2 2.2. Niveaux de contrôle .................................................................................................................... 3 2.3. Fréquence des contrôles ............................................................................................................. 3 2.4. Paramètres à contrôler ............................................................................................................... 3 3. Prélèvement, transport et préparations des échantillons ................................................................ 4 3.1. Prélèvement des échantillons .................................................................................................... 4 3.1.1. Echantillonnage ................................................................................................................... 4 3.1.2. Fréquence des prélèvements .............................................................................................. 8 3.1.3. Conditions du prélèvement ................................................................................................. 8 3.1.4. Prélèvement en surface ....................................................................................................... 9 3.1.5. Prélèvement de produits liquides ..................................................................................... 10 3.1.6. Prélèvement de produits solides ....................................................................................... 10 3.2. Emballage et transport des échantillons .................................................................................. 10 3.3. Préparation de l’échantillon ..................................................................................................... 10 3.4. Techniques de dilutions ............................................................................................................ 11 3.5. La revivification......................................................................................................................... 13 4. Techniques classiques de numérations ........................................................................................... 13 4.1. Numération microscopique ...................................................................................................... 13 4.2. Numération en milieu solide .................................................................................................... 15 4.2.1. Technique de numération dans la masse de la gélose ...................................................... 15 4.2.2. Technique de numération en surface de la gélose ........................................................... 16 4.2.3. Dénombrement après filtration sur membrane ............................................................... 16 4.3. Numération en milieu liquide .................................................................................................. 17 4.3.1. Dénombrement à un seul essai ......................................................................................... 18 4.3.2. Dénombrement à essais multiples «technique du nombre le plus probable NPP» ......... 18 5. Autres méthodes d’évaluation de flores microbiennes .................................................................. 19 5.1. Spectrophotométrie ................................................................................................................. 19 5.2. Spectrométrie de masse ........................................................................................................... 20 5.3. Cytométrie de flux .................................................................................................................... 20 5.4. Impédancemétrie ..................................................................................................................... 20 6. Identification des microorganismes ................................................................................................ 21 6.1. Caractères morphologiques ..................................................................................................... 21 6.2. Caractères culturaux ................................................................................................................. 21 6.3. Composition chimique .............................................................................................................. 22 6.4. Caractéristiques métaboliques ................................................................................................. 22 6.5. Caractéristiques sérologiques .................................................................................................. 22 6.6. Pouvoir pathogène ................................................................................................................... 23 7. Réalisation du contrôle.................................................................................................................... 23 7.1. Contrôle des matières premières ............................................................................................. 23 7.2. Contrôle de la fabrication ......................................................................................................... 24 7.3. Contrôle du nettoyage et de la désinfection ............................................................................ 24 7.4. Contrôle des produits finis ....................................................................................................... 25 ii Listes des figures et des tableaux Figure 1. Distribution des échantillons d’après l’ICMSF ......................................................................... 6 Figure 2. Ecouvillonnage ........................................................................................................................ 9 Figure 3. Broyeurs pour échantillons solides........................................................................................ 11 Figure 4. Préparation des dilutions ...................................................................................................... 12 Figure 5. Cellule de Malassez ............................................................................................................... 14 Figure 6. Lecture de la cellule de Malassez .......................................................................................... 15 Figure 7. Filtration sur membrane ....................................................................................................... 17 Figure 8. Galeries d’identification ........................................................................................................ 22 Figure 9. Lames gélosées...................................................................................................................... 24 Tableau 1. Composition de certains diluants ....................................................................................... 11 Tableau 2. Dénombrement en milieu liquide à un seul essai ............................................................... 18 Tableau 3. Dénombrement par la technique du nombre le plus probable .......................................... 18 Tableau 4. Table de Mac Grady ............................................................................................................ 19 Tableau 5. Concentration cellulaire approximative par spectroscopie ................................................ 20 1 Techniques de contrôle microbiologiques Les fabrications dans les bio-industries supposent la maîtrise des développements microbiens, aussi bien des souches de cultures utilisées en fermentation, si une telle étape intervient dans la fabrication, que des microorganismes contaminants. En effet, un levain dont le taux de croissance serait trop faible ne permet pas de réaliser des fermentations correctes. Par ailleurs des microorganismes contaminants peuvent perturber, à des degrés divers, le déroulement de la fabrication et mettre en cause la qualité et la conservation du produit final. 1. Objectifs du contrôle microbiologique Les contrôles doivent permettre de garantir une bonne qualité hygiénique et une bonne qualité marchande du produit fabriqué. De plus, les contrôles doivent permettre de minimiser les pertes dues à des mauvaises conditions de fabrication et donc d’avoir le moins possible de produits non conformes. 1.1. Qualité hygiénique Une altération de la qualité hygiénique met en cause la santé du consommateur, le produit altéré conduisant à des intoxications alimentaires de gravité diverse suivant la nature des microorganismes en cause. Cette altération est généralement invisible. Elle est due à un développement de microorganismes pathogènes produisant des toxines, deux cas peuvent alors se présenter : - la toxine est excrétée dans le produit (exotoxine). A partir d’une certaine quantité de toxine, le produit est dangereux à consommer même si le microorganisme n’est plus vivant dans le produit. C’est le cas de staphylocoques pathogènes ou de Clostridium botulinum ; - la toxine n’est pas secrétée mais reste dans les cellules microbiennes (endotoxine). Pour que le produit soit dangereux pour le consommateur, le microorganisme doit être présent et vivant. C’est le cas des entérobactéries par exemple. Les contrôles microbiologiques permettent donc d’éviter la présence de microorganismes dans les produits afin de ne pas risquer une altération de la qualité hygiénique des produits finis ou au moins détecter ces microorganismes s’ils sont présents dans les produits finis avant leur commercialisation. 1.2. Qualité marchande Une altération de la qualité marchande modifie la texture et la qualité organoleptique du produit. Cette altération bien que généralement non dangereuse pour la santé du consommateur, rend le produit non commercialisable. Cette altération survient lorsque la technologie mise en œuvre pour assurer la stabilité microbiologique a été défaillante. La nature des microorganismes responsables de ces altérations dépend étroitement du type de produit et de la technologie mise en œuvre. Exemple, des levures osmophiles peuvent se développer et donc altérer (gonflement) un produit sucré à faible activité d’eau si ce facteur n’a pas été parfaitement maitrisé. L’altération de la qualité marchande se produit généralement lentement au cours du stockage. Les contrôles microbiologiques ont pour objectif de détecter les microorganismes pouvant être responsables de ces altérations, et de vérifier l’efficacité des technologies après leur application afin de stocker et de commercialiser les produits microbiologiquement stables. 2 La bonne qualité microbiologique (hygiénique et marchande) est fonction de très nombreux facteurs ; le microbiologiste se doit néanmoins de définir le plus rapidement possible la notion quantitative et qualitative de flore normale de son produit ou de ses matières premières (microorganismes «habituels» et tolérables) et d’une flore contaminante dont le seuil de tolérance sera défini en fonction du risque que fait courir cette flore au consommateur. La Technologie est l’aptitude à la transformation et à la distribution. La qualité d’un produit doit satisfaire tous les utilisateurs. Le consommateur n'est pas le seul utilisateur (les transformateurs, artisans et industriels, les distributeurs, magasins et grandes surfaces, attendent eux aussi des caractéristiques précises des produits), il s'agit des «Qualités Technologiques». Exemple : qualité boulangère d'une farine de blé, qualité de rétention d'eau d'une viande destinée à la salaison, qualité de conservation d'un yaourt, ... 2. Politique de contrôle La politique de contrôle dans chaque usine doit être établie en faisant appel à la réflexion et au bon sens pour éviter des pertes importantes dues à des interventions tardives. Le contrôle microbiologique doit donc permettre de surveiller pas à pas les fabrications. Le contrôle microbiologique occupe une place privilégiée dans les procédures de mise sous assurance-qualité. Il comporte quatre démarches en interaction : - L’évaluation (par exemple d’un niveau de qualité existant) ; - La définition d’un objectif (amélioration de la qualité) ; - La préparation (mise en place de moyens nécessaires pour atteindre l’objectif retenu) ; - L’exécution (réalisation de la production à l’aide des dispositifs mis en place). Le système HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point) ou encore ADPCM (Analyse des Dangers et des Points Critiques pour leur Maîtrise) utilise une démarche où le contrôle microbiologique joue un rôle essentiel. En effet, à chaque point critique, en se basant sur des critères microbiologiques, un niveau seuil (défini) de contamination microbienne ne doit pas être dépassé. Le contrôle microbiologique a deux fonctions distinctes : - Evaluer la qualité microbiologique d’un produit ou d’une matière première ; - Maîtriser un point critique sur une chaine de production. 2.1. Les spécifications microbiologiques Les spécifications microbiologiques sont des critères applicables pendant et après la préparation afin de s’assurer que l’hygiène et les conditions de production sont satisfaisantes et en accord avec la règlementation. Les parties prenantes d’un marché y trouveront des garanties. Les normes sont des spécifications microbiologiques adoptées par la législation qui s’adressent au produit fini et fixent les limites acceptables de présence de microorganismes donnés dans des produits bien définis. Il existe actuellement de nombreux organismes nationaux ou internationaux qui se préoccupent de l’établissement de critères de qualité microbiologique comme : 3 FAO (Food and Agriculture Organisation)- L’OMS (Organisation mondiale de la Santé)- L'ISO (Organisation Internationale de Normalisation)- Le comité technique 34 (CT34) concernant les produits agroalimentaires- Le Codex alimentarius crée en 1963 par la FAO et l'OMS- Le CEN (Comité européen de normalisation) ... 2.2. Niveaux de contrôle Les contrôles doivent être répartis en trois groupes : - Les contrôles préventifs sont effectués sur les matières premières et les différents adjuvants. Dans le cas où le processus de fabrication fait intervenir une fermentation, des contrôles microbiologiques sur le levain sont nécessaires. - Les contrôles en cours de fabrication comprennent uploads/Industriel/ 3eme-micro-2019-2020-cours-techniques-de-controle-microbiologique.pdf