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See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/320242907 Modiﬁcations ciblées des génomes : Apports et impacts pour les espèces d’élevage Article in INRA Productions Animales · January 2017 DOI: 10.20870/productions-animales.2017.30.1.2226 CITATIONS 6 READS 439 4 authors, including: Some of the authors of this publication are also working on these related projects: The National Observatory of Bovine Abnormalities View project FatInteger View project Bertrand Bed'Hom Muséum National d'Histoire Naturelle 306 PUBLICATIONS 3,326 CITATIONS SEE PROFILE Hervé Acloque French National Institute for Agriculture, Food, and Environment (INRAE) 100 PUBLICATIONS 10,293 CITATIONS SEE PROFILE All content following this page was uploaded by Hervé Acloque on 08 August 2019. The user has requested enhancement of the downloaded file. Les premières souris transgéniques ont été produites dès le début des années 1980 par micro-injection de matériel génétique exogène dans l’un des pro- noyaux d’œufs fécondés (Gordon et Ruddle 1981). La même technique a été utilisée, quelques années plus tard, pour produire les premiers animaux d’élevage génétiquement modifiés, mammifères (lapins, moutons et porcs ; Hammer et al 1985), ou poissons (saumon, truite et carpe notamment ; Zhang et al 1990, Du et al 1992). En revanche, les spécificités de l’embryon des espèces aviaires ont nécessité le recours à d’autres techniques, comme l’infection rétro- et lentivirale d’embryons à des stades précoces du développement, pour obtenir les premiers poulets transgéniques à la fin des années 1980 (Bosselman et al 1989, Salter et Crittenden 1989, Nishijima et Iijima 2013). Entre autres limites, ces méthodes « historiques » de transgénèse présentent l’inconvénient majeur de ne maîtriser ni les sites d’insertion des transgènes, ni le nombre de copies effectivement intégrées dans le génome des cellules ciblées (Essalmani et al 2000), rendant les pro- fils d’expression des transgènes généra- lement peu prédictibles. Par exemple, des effets de position peuvent fortement influencer la transcription des transgènes (Clark et al 1994). Chez la souris, la pos- sibilité de modifier le génome de façon précise par Recombinaison Homologue (RH) dans des cellules Embryonnaires Souches (ES) a été démontré dès 1989 (Capecchi 1989) et a constitué une avan- cée scientifique majeure pour la recher- che en biologie. La manipulation des cellules ES reste cependant impossible dans la plupart des espèces de mammi- fères d’élevage, et non pertinente chez le poulet car elle ne permet pas la trans- mission des modifications génétiques à la lignée germinale (Nishijima et Iijima 2013, Schusser et al 2013). Des approches alternatives ont donc été recherchées et proposées. Chez les mammifères, des modifications ciblées de cellules somatiques en culture par RH, suivies de clonage par transfert de noyaux (« somatic cell nuclear transfer », ou SCNT) ont été réalisées. Les premiers résultats probants ont été obtenus chez le mouton et publiés dès 2000 (Mc Creath et al 2000). Cependant, cette approche demeure longue, fastidieuse, et d’une efficacité limitée. Chez le poulet, l’utili- sation de la RH dans des cellules germi- nales primordiales en culture (PGC) a permis de produire les premiers animaux recombinants pour un locus défini d’im- munoglobuline, mais avec une efficacité là encore limitée (1 clone cellulaire modifié pour 107 cellules transfectées ; Schusser et al 2013). Une possibilité d’améliorer cette effi- cacité de façon importante est apparue avec le concept de « nucléases program- mables », permettant de générer des cassures double-brin au niveau de régions précises de la séquence d’ADN (voir la synthèse de Chandrasegaran et Carroll 2016). Les premières techniques basées sur ce concept (« Zinc Finger Nucleases » ou ZFN en 1996, « Trans- cription Activator-Like Effector Nuclease » ou TALEN en 2010), malgré leur effica- cité avérée, sont toutefois d’utilisation délicate, du fait notamment de la com- plexité de leur élaboration et de leur coût élevé. Une avancée décisive a eu lieu avec le développement de la tech- nique CRISPR-Cas9 (Jinek et al 2012), beaucoup plus simple en termes de conception et d’utilisation, moins coûteuse, et, de ce fait, bien plus accessible (Jo et al 2015). À ce jour, son efficacité a été démontrée dans plus de 40 espèces (Haeussler et Concordet 2016), et ses perspectives d’utilisation sont considé- rables (Hsu et al 2014). Dans la suite de cet article, nous pré- senterons les principes généraux de cette méthode d’ingénierie ciblée des génomes, considérée par d’aucuns comme une révolution dans le monde de la bio- logie (Ledford 2015a, Lander 2016). Ses applications en recherche fondamen- tale et médicale, en ingénierie écologique INRA Productions Animales, 2017, numéro 1 INRA Prod. Anim., 2017, 30 (1), 3-18 A. DUCOS1, B. BED’HOM 2, H. ACLOQUE1, B. PAIN3 1 GenPhySE, Université de Toulouse, INRA, INPT, INP-ENVT, 31320, Castanet Tolosan, France 2 GABI, AgroParisTech, INRA, Université Paris-Saclay, 78350, Jouy-en Josas, France 3 Univ Lyon, Université Lyon 1, INSERM, INRA, Stem Cell and Brain Research Institute, CSC USC1361, 69675, Bron, France Courriel : a.ducos@envt.fr Modifications ciblées des génomes : apports et impacts pour les espèces d’élevage La technique CRISPR-Cas9 permet de modifier les génomes de façon fine et efficace. Elle ouvre de nouvelles perspectives pour le développement de lignées d’animaux génétiquement modifiés. Si des applications a priori intéressantes sont envisagées dans les filières de productions animales, notamment dans le domaine de la santé, ces nouvelles techniques posent également de nombreuses questions d'ordre scientifique, éthique, réglementaire, économique et stratégique1. 1 Un extrait de cette revue sera présenté lors des Journées de la Recherche Avicole et Palmipèdes à Foie Gras (Tours) le 6 avril 2017. 4 / A. DUCOS, B. BED’HOM, H. ACLOQUE, B. PAIN INRA Productions Animales, 2017, numéro 1 ou dans certains domaines industriels particuliers (pharmacie, biotechnologies blanches...) seront évoquées brièvement, avant de présenter plus longuement son utilisation à des fins agronomiques (filiè- res de productions animales). Les limi- tes de cette technique, les questions qu’elle soulève (aspects éthiques, régle- mentaires, économiques ...) seront éga- lement présentées et discutées. 1 / Présentation de la tech- nique CRISPR-Cas 9 1.1 / CRISPR-Cas9 : un système immunitaire bactérien CRISPR est l’acronyme de « Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats » : séquences répétées palindro- miques courtes (30 bases) regroupées et régulièrement intercalées avec d’autres séquences qualifiées de « spacers », vestiges de séquences de bactériophages ou de plasmides, d’environ 36 bases. Ce type particulier de motif a été observé dès la fin des années 1980 dans le génome d’Escherichia coli, puis, rapidement, dans de nombreuses autres espèces de bacté- ries et d’archées. L’évolution des connais- sances dans ce domaine est bien résumée par Lander (2016). Des gènes codant des protéines aux fonctions variées (hélica- ses, exonucléases...) ont été identifiés à proximité de ces séquences CRISPR. Ces gènes « Cas », pour « CRISPR- associated genes », dont le gène Cas9, sont directement liés à la fonction de ces système biologiques (immunité adapta- tive chez les procaryotes, voir la synthèse de Marraffini 2015). 1.2 / CRISPR-Cas9 : un outil révolutionnaire d’ingénierie ciblée des génomes Les travaux de microbiologie molécu- laire ont permis des progrès importants dans notre compréhension du fonction- nement de ces systèmes. Cependant, si CRISPR-Cas9 induit une telle efferves- cence depuis quelques années dans la communauté scientifique, et bien au- delà, c’est en raison de son utilisation possible pour générer des cassures au niveau de régions très précises de l’ADN, dans potentiellement tout type de cellu- les : animales, végétales, microbiennes. L’idée initiale de « détourner » ce sys- tème bactérien pour en faire un outil d’ingénierie ciblée des génomes, ainsi que les premières preuves de concepts, sont à porter au crédit de plusieurs scien- tifiques très médiatisés ces derniers temps, comme, d’une part, le tandem Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna (Doudna et Charpentier 2014), et, d’autre part, Feng Zhang (Zhang 2015). Ces chercheurs et leurs institu- tions respectives s’opposent frontalement depuis quelques années pour revendiquer la paternité du système (« guerre des brevets », Ledford 2016). Cette opposi- tion, qui atteint des proportions inédites, pourrait avoir des conséquences sur les utilisations scientifiques et commercia- les futures de ces systèmes (Egelie et al 2016). a) CRISPR-Cas9 : principes généraux Le principe général de l’outil CRISPR- Cas9 est relativement simple, et schéma- tisé sur la figure 1. Comme c’était déjà le cas pour ZFN ou TALEN, CRISPR- Cas9 est constitué de deux composants principaux : un dispositif (ou domaine) de « guidage », permettant la reconnais- sance par hybridation d’une séquence cible sur le génome de la cellule à modi- fier, et un domaine de « clivage » enzy- matique, générant des cassures double- brin de la molécule d’ADN au niveau de la (ou des) région(s) ciblée(s) (on parle de « ciseaux moléculaires »). Deux éléments principaux différencient CRISPR-Cas9 des systèmes antérieurs ZFN et TALEN. Le premier est la nature du dispositif de guidage. Dans le cas de CRISPR-Cas9, ce dispositif est constitué d’une simple molécule d’ARN guide, ou sgRNA, dont une partie permet l’asso- ciation à l’enzyme Cas9, et une vingtaine de bases sont complémentaires de la séquence cible. Dans le cas de ZFN ou TALEN, le dispositif de guidage est un complexe protéique, plus difficile à pro- duire. L’autre élément de différenciation est la nature de l’enzyme associée au uploads/Industriel/ modifications-ciblees-des-genomes-apports-et-impacts.pdf