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HAL Id: tel-00340464 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00340464 Submitted on 20 Nov 2008 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. ETUDE STRUCTURALE PAR MICROSCOPIE ELECTRONIQUE ET CRISTALLOGRAPHIE AUX RAYONS X DE LA CAPSIDE DES ADENOVIRUS Celine Fabry To cite this version: Celine Fabry. ETUDE STRUCTURALE PAR MICROSCOPIE ELECTRONIQUE ET CRISTAL- LOGRAPHIE AUX RAYONS X DE LA CAPSIDE DES ADENOVIRUS. Biochimie [q-bio.BM]. Uni- versité Joseph-Fourier - Grenoble I, 2008. Français. tel-00340464 THESE Pour l’obtention du diplôme de Docteur de l’Université Joseph Fourier - Grenoble I Spécialité : Biologie structurale et Nanobiologie Présentée et soutenue publiquement par : Céline Fabry Le 24 Septembre 2008 à 14h ETUDE STRUCTURALE PAR MICROSCOPIE ELECTRONIQUE ET CRISTALLOGRAPHIE AUX RAYONS X DE LA CAPSIDE DES ADENOVIRUS Devant le jury composé de : Pr Pierre Boulanger Rapporteur Dr Daniel Thomas Rapporteur Dr Serge Perez Président du Jury Dr Daniel Levy Examinateur Dr Guy Schoehn Directeur de thèse Pr Rob Ruigrok Co-directeur de thèse Travaux effectués à l’UVHCI, Unit of Virus Host Cell Interactions. Résumé Les Adénovirus sont des virus non enveloppés à symétrie icosaédrique. Découverts chez l’homme dans les années 50, ils constituent la famille des Adenoviridae. Ils existent une grande variété de souches pouvant infecter une grande variété d’hôtes allant de l’homme jusqu’au poisson. L’étude de l’Adénovirus a été stimulée par la découverte en 1962 par Trentin et collaborateurs de leur capacité à induire des tumeurs chez les bébés hamsters. Sur le plan structural, de nombreuses études en Microscopie Electronique ont été menées pour comprendre l’assemblage et la formation de la capside. Depuis les années 90, avec la progression de l’informatique et des techniques liées à l’analyse d’images, la structure de la capside des Adénovirus humains est de mieux en mieux comprise mais la localisation de certaines protéines mineures restaient encore incertaine ou inconnue. Nous avons, à travers l’utilisation de la Microscopie Electronique associée à l’analyse d’images, obtenu des reconstructions 3D pour plusieurs souches d’Adénovirus humains, canins et aviaires. L’obtention d’un modèle 3D à haute résolution pour l’Adénovirus humain de type 5 nous a permis de reconstituer un modèle quasi- atomique par la méthode de « fitting » et de déterminer avec plus de précisions la position de certaines protéines mineures comme la protéine IX, IIIa et VIII. L’étude d’une souche mutante d’Adénovirus de type 5 en complexe avec un Fab ainsi que d’une souche canine nous a permis de localiser précisément l’extrémité C terminale de la protéine IX. Enfin l’obtention d’une structure à haute résolution d’un virus immature dérivé de l’Adénovirus humain de type 2 a ouvert la voie sur l’étude et la compréhension de la maturation et de la phase précoce de son cycle cellulaire. Mots-clés: Adénovirus, Adenoviridae, Microscopie Electronique, Reconstruction 3D, Fitting, Cristallographie, Virus à ADN double brin, symétries icosaédriques. Abstract Adenoviruses are non-enveloped icosahedral viruses. They were found during the 50’s and since constitute the huge Adenoviridae family. You can found a large variety of strains able to infect a large variety of hosts from humans to fishes. Fundamental studies on adenoviruses were largely stimulated since the discovery in 1962 by Trentin et al. of their ability to induce tumours in baby hamsters. From the structural point of view, many studies based on electron microscopy were done to understand how the adenovirus capsid is assembled. Since the last fifteen years, progress made in computer science and Electron Microscopy based techniques for 3D image analysis helped scientific community to get a better understanding of the adenovirus capsid structure but many minor proteins were uncertainly localised or totally unknown. Our work is based on Electron Microscopy and 3D image analysis. We obtained 3D models of different adenovirus strains like human, fowl and canine ones where two are below 10 Å resolution. A high resolution 3D reconstruction of Human Adenovirus type 5 helped us to reconstitute a quasi atomic model of the entire capsid and to determine the localisation of minor proteins like IX, IIIa and VIII. We also localised the C terminal part of protein IX from a 3D model of a mutant Human Adenovirus type 2 complexed with a Fab antibody and a canine Adenovirus. Finally, we were interested in the 3D structure of the non mature strain ts1 derived from Human Adenovirus type 2. The “below10Å” 3D reconstruction obtained constitutes infancy into structural understanding of adenovirus maturation and early phase of infection. Keywords: Adenovirus, Adenoviridae, Electron Microscopy, 3D reconstruction, Fitting, Crystallography, Double-stranded DNA viruses, icosahedral symmetries. Je remercie tout d’abord mes directeurs de thèse, le Dr. Guy Schoehn et le Pr. Rob Ruigrok avec qui j’ai beaucoup apprécié travailler durant mes quatre années de thèse. Je suis très reconnaissante de la patience dont ils ont fait preuve surtout pendant la dernière année. Ils ont accepté de me laisser plus de temps pour la rédaction de ce manuscrit et la préparation de ma soutenance. Cela m’a permis de mener à bien ma formation en Informatique. Je tiens à les remercier particulièrement pour cela. J’espère ne pas avoir trop traumatisé Guy en parlant à mon ordinateur lorsque nous partagions le même bureau. Je remercie le Pr. Pierre Boulanger et le Dr. Daniel Thomas d’avoir accepté de lire ce manuscrit et d’être les rapporteurs de mon travail de thèse. J’aimerais aussi remercier tous les membres de mon jury, le Dr. Serge Perez, le Dr. Daniel Levy ainsi qu’à mes deux directeurs de thèse pour leur participation. J’aimerais ensuite remercier toutes les personnes avec qui nous avons collaboré pour mener à bien ce projet de thèse sur l’étude de la structure des Adénovirus. A Lyon le Pr. Pierre Boulanger et le Dr. Manuel Rosa-Calatrava, à Montpellier le Dr. Eric Kremer, et à Zurich le Dr. Greber ainsi que leurs équipes respectives. Dans notre laboratoire, j’aimerais tout particulièrement remercier mes amis encore au labo comme Francine Gérard, Majida El Bakkouri, Lucy Freeman, et ceux qui en sont partis : Thibault Géoui, Aurélie Albertini, Sophie Torres, Hatice Akarsu, Cédric Clapier, Jeanne Morinière, Carlos Fernando-Tornero pour tous les moments que nous avons passé ensemble. C’est vous tous qui m’avait fait aimé la vie au laboratoire. J’aimerais maintenant remercier mes parents, Rose et Robert Fabry sans qui rien n’aurais pu arriver. Ils m’ont toujours soutenu dans mes choix quelque soit leur direction Cela m’a toujours beaucoup touché. La dernière personne à qui je dois beaucoup est la personne qui partage ma vie et qui l’a partagé durant toute ma thèse, Cyril Dian. Cyril m’a aussi toujours soutenu psychologiquement pendant l’écriture de cette thèse. Je tiens à exprimer toute mon affection et mon amour à Cyril pour sa présence et son soutien. Malgré les difficultés que j’ai éprouvées pour rédiger ce manuscrit et soutenir ma thèse, je tiens à ce que vous sachiez que mon doctorat a été une expérience formidable pleine d’enrichissements aussi bien personnels que professionnels. Si un petit génie me demandait de remonter le temps pour changer quelque chose à ma vie, je ne changerais rien à tout ca. Cette thèse a été pour moi une grande expérience de vie :-) Table des Matières INTRODUCTION .............................................................................................................1 I. La symétrie, un aspect fascinant de la nature............................................................................. 1 I.1 Les opérateurs de symétrie élémentaires ...........................................................................................................2 I.2 Les Solides de Platon .......................................................................................................................................5 I. 2.1 Le cube...........................................................................................................................................................................6 I. 2.2 Le tétraèdre ....................................................................................................................................................................7 I. 2.3 L’octaèdre.......................................................................................................................................................................7 I. 2.4 L’icosaèdre......................................................................................................................................................................8 I. 2.5 Le dodécaèdre.................................................................................................................................................................9 I.3 La Symétrie dans les macromolécules biologiques et les virus ...........................................................................9 II. La combinaison des données issues de la Microscopie Electronique et de la cristallographie aux rayons X, une méthode très adaptée à l’étude structurale de gros complexes macromoléculaires .....14 II.1 La Microscopie Electronique........................................................................................................................14 II. 1.1 Le principe de la Microscopie Electronique en transmission............................................................................................15 II. 1.2 Le microscope électronique produit une image déformée de l’objet ..................................................................................17 II. 1.3 La préparation des échantillons biologiques et la prise d’images en MET........................................................................20 II. 1.4 La correction, l’analyse des images et le calcul d’une reconstruction 3D.........................................................................24 II.2 La Cristallographie aux rayons X..................................................................................................................30 II.3 Obtention d’un modèle quasi-atomique par « fitting »..................................................................................30 II. 3.1 En corps rigide ............................................................................................................................................................31 II. 3.2 Les modes normaux et le « fitting » flexible ...................................................................................................................33 III. Objet du travail de thèse ......................................................................................................34 STRUCTURE DE LA CAPSIDE DES ADENOVIRUS ET DES SOUS PARTICULES VIRALES............................................................................................................................35 I. Introduction ..........................................................................................................................35 I.1 La famille des Adenoviridae............................................................................................................................35 I.2 Un peu d’épidémiologie ................................................................................................................................37 I.3 Structure et organisation générale de la capside..............................................................................................38 I. 3.1 La symétrie de la capside ...............................................................................................................................................40 I. 3.2 L’Hexon.......................................................................................................................................................................41 I. 3.3 La Base du Penton........................................................................................................................................................42 I. 3.4 La Fibre.......................................................................................................................................................................44 I. 3.5 Les protéines structurales mineures.................................................................................................................................45 I.4 Structure et Organisation du génome des Adénovirus....................................................................................47 I. 4.1 Structure du nucléoïde ..................................................................................................................................................48 I. 4.2 Unités transcriptionnelles et organisation du génome ......................................................................................................48 I.5 Le cycle viral..................................................................................................................................................51 I. 5.1 Entrée du uploads/Ingenierie_Lourd/ celinefabry-thesis.pdf