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Chromatographie : I. Introduction : La chromatographie est une technique d'anal

Chromatographie : I. Introduction : La chromatographie est une technique d'analyse chimique de la chimie analytique pouvant être couplée à un détecteur en vue d'une analyse qualitative et/ou quantitative. En chromatographie, l'échantillon contenant une ou plusieurs espèces est entraîné par un courant de phase mobile (liquide, gaz ou fluide supercritique) le long d'une phase stationnaire (papier, gélatine, silice, polymère, silice greffée etc). Chaque espèce se déplace à une vitesse propre dépendant de ses caractéristiques et de celles des deux phases. I-1.Histoire Le botaniste russe Mikhail Tswett (1872-1919) fut, en 1960, le premier à utiliser le terme chromatographie. partir de 1903, Tswett utilisa des colonnes d'adsorption pour séparer des pigments de plantes. On spécula donc l'étymologie du mot « chromatographie » à partir du grec khrôma- pour couleur et donc pigment. Toutefois, Tswett ne donna jamais cette explication, mais tswett est le mot russe pour « couleur ». En 1952, Martin et Synge reçurent le prix Nobel de chimie pour leur invention de la chromatographie de partage ] . I-2.Terminologie Le mot chromatographie vient du grec ancien Khrôma qui signifie "couleur" et Graphein qui signifie "écrire" I-3.Définitions: la Chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différences d'affinités des substances à analyser à l'égard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successive sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase. Phase stationnaire : phase fixe soit sur la surface intérieure d'une colonne soit sur une surface plane. Phase mobile : phase qui se déplace à travers la phase stationnaire, en entraînant les 1analytes. La phase mobile ne doit pas interagir avec la phase stationnaire mais uniquement avec les analytes. Chromatogramme : graphique d’une fonction de la concentration en analyte en fonction du temps (ou du volume) d’élution. I-3-1 .La chromatographie analytique Est utilisée pour identifier ou doser les composés chimiques d'un mélange et apprécier leur concentration. I-3-2.La chromatographie préparative Est utilisée pour purifier assez de produit pour d'autres utilisations. Son but est d'obtenir de la substance ; c'est pourquoi, à toute échelle, elle implique de collecter des fractions. I-4 Principe général de tous les types de chromatographie La chromatographie repose sur l'entraînement d'un échantillon dissous par une phase mobile à travers une phase stationnaire. Celle-ci retient plus ou moins fortement les substances contenues dans l'échantillon dilué selon l'intensité des forces d'interactions de faible énergie (comme les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène, etc.) réalisées entre les différentes espèces moléculaires et la phase stationnaire. Les différents composants de l'échantillon ont généralement une vitesse caractéristique qui permet de les séparer, voire de les identifier. Cette vitesse de séparation est fortement dépendante de la nature de la phase mobile et de la phase stationnaire. Souvent, l'échantillon est analysé par comparaison avec des substances déjà connues dans l'échantillon ou par comparaison avec les résultats de l'analyse d'une solution-étalon (solution commerciale contenant des substances connues, à des concentrations bien connues). Ces substances servent de références et permettent d'identifier ou de doser chaque espèce par comparaison des vitesses de séparation (et éventuellement d'autres renseignements donnés par la détection). Il s'agit de chromatographie analytique. Dans d'autres cas, on se contente de séparer les fractions, de les récolter pour les identifier par d'autres techniques : c'est la chromatographie préparative. Il existe de nombreux types de chromatographie ; on peut notamment les classer selon la nature de la phase mobile : · la chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC en anglais) ; · la chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC en anglais) également appelée CPV (chromatographie en phase vapeur) ; · la chromatographie en phase liquide (CPL ou LC en anglais) ; · la chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP ou HPLC en anglais) ; · la chromatographie en phase supercritique (CPS ou SFC en anglais). On peut aussi les nommer selon les interactions développées par la phase stationnaire : · la chromatographie d'adsorption/d'affinité ; · la chromatographie de partage ; · la chromatographie à échange d'ions ; · la chromatographie chirale (qui est, soit de la CPG, soit de la CPL) ; · la chromatographie d'exclusion stérique (CES ou SEC en anglais) ; Ou selon le support de la phase stationnaire : · la chromatographie sur colonne (regroupant notamment HPLC et CPG) : la phase stationnaire est dans un tube étroit et la phase mobile progresse par gravité ou différence de pression ; · la chromatographie planaire (qui recouvre CCM et chromatographie sur papier) : la phase stationnaire est sur la surface d'un support plat (CCM) ou dans une feuille de cellulose poreuse (chromatographie papier) et la phase mobile se déplace par capillarité ou par gravité. II. Chromatographie sur couche mince II-1.Définition La chromatographie sur couche mince ou chromatographie planaire (CCM, en anglais TLC pour Thin layer chromatography) est une technique de chromatographie couramment utilisée pour séparer des composants dans un but d'analyse (CCM analytique) ou de purification (CCM préparative). Elle comprend :  une phase stationnaire : une couche mince de matériel adsorbant (usuellement du gel de silice, de l'oxyde d'aluminium ou de la cellulose)  une phase liquide, dite phase mobile ou 399999éluant : un solvant ou un mélange de solvants qui va entraîner les composés à séparer le long de la phase stationnaire. Le phénomène d’adsorption est prépondérant (Mais il y a également partage si le solvant est un mélange). II-2.Constitution d'une plaque de CCM Une plaque de CCM est un support en verre, en aluminium ou en plastique sur lequel a été étalée une phase stationnaire en couche uniforme. L'épaisseur de cette couche est de l'ordre de 0,2 mm pour une plaque analytique et 1-3 mm pour une plaque préparative. Avant étalement, la phase stationnaire est une poudre fine et elle doit donc être mélangée à un liant qui assure la bonne cohésion de la couche et une bonne adhérence au support. On utilise le plus fréquemment un liant inorganique comme du sulfate de calcium hémihydraté, ou un liant organique (par exemple l'alcool polyvinylique) notamment lorsque la phase stationnaire est hydrophobe. On ajoute souvent un pigment fluorescent pour permettre une détection des produits à la lumière ultraviolette à 254 nm ou 366 nm ; à cette longueur d'onde, le pigment de la phase stationnaire émet une lumière, verte en général, sauf aux endroits où un produit absorbe le rayonnement UV ce qui provoque l'apparition de taches sombres. II-3. Principe de la technique Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l'échantillon est placée dans la cuve, l'éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque composant de l'échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. Cette vitesse dépend d'une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur la plaque stationnaire et, d'autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les composés se déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile, l'action de rétention de la phase stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes d'adsorption. Généralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires. II-4.Calcul de Rf (rapport frontal) Le rapport Rf permet de caractériser une espace chimique dans un éluant donné. Le rapport frontal entre di et ds. Rf=di / ds di : distance parcourue par le composé (mesure au centre de la tache) ds : distance parcourue par le front d u solvant di et sont exprimes de même unité, Rf sans unité. Rf est toujours indépendant de la longueur de bande utilisée. II-5.Description par ccm selon l ordre chronologique II-5-1.Préparation de la cuve chromatographique : • Introduire l'éluant ou le mélange de solvants. • Ajuster le niveau à environ 0,5 cm du fond de la cuve. • Fermer le récipient (la cuve doit être saturée de vapeur de solvant). Pour que la saturation et l'élution soient plus rapides, on peut placer une bande de papier filtre contre les parois de la cuve chromatographique. II-5-2.Dépôt de l'échantillon sur la plaque : • Procéder au nettoyage de la plaque si nécessaire. • Dissoudre l'échantillon dans un solvant approprié en solution de 2 à 5 % . • Déposer environ 0,5 μl de la solution en un point situé à 1 cm de l'extrémité inférieure de la plaque; le diamètre de la tache doit être d'environ 2 mm pour la disposition de plusieurs produits. • Sécher à l'aide d'un séchoir; éventuellement faire de nouvelles applications II-5-3.Développement du chromatogramme : • Placer la plaque dans la cuve en position verticale. • Refermer le récipient. • Lorsque le front du solvant se trouve à environ 1 cm de l'extrémité supérieure de la plaque, la retirer et marquer cette position.(le trait peut être tracé à l'avance et servir de repère pour arrêter l'élution). II-5-4.Révélation et calcul de Rf : • Sécher la plaque à l'aide d'un séchoir • Révéler les taches sous une lampe U V ou à l'aide uploads/Management/ chromatograph-i-1.pdf