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Expose de BCH 327 THEME : DOSAGE EN CHROMATOGRAPHIE : EXPLORATION DES DIFFERENT

Expose de BCH 327 THEME : DOSAGE EN CHROMATOGRAPHIE : EXPLORATION DES DIFFERENTES METHODES UTILISEES EN ANALYSE QUANTITATIVE HPLC ET CPG - OPTION CLINIQUE MASTER 1 - GROUPE 4 LISTES DES MEMBRES DU GROUPE N°- NOMS ET PRENOMS MATRICULES 1 ALOMO KENDJOUA MARTIN LEA CM-UDS-17SCI1750 2 GUIDDAM DIGUIM - 3 YOUDA TEVOU AURIANE CM-UDS-17SCI0601 4 PAULIN HLAM-NGOLO - 5 NOPELBA OUAINBE - 6 GWET DEBORAH NADEGE CM-UDS-17SCI0933 7 DJOURGONBE LABA Supervisé par Pr KUATE Dieudonné RÉPUBLIQUE DU CAMEROUN REPUBLIC OF CAMEROON Peace – Work - Fatherland UNIVERSITÉ DE DSCHANG UNIVERSITY OF DSCHANG Scholae Thesaurus DschangensisIbiCordum BP 96, Dschang (Cameroun) – Tél./Fax (237) 233 45 13 81 Website : . E-mail :udsrectorat@univ-dschang.org FACULTÉ DES SCIENCES FACULTY OF SCIENCE Département de Biochimie Department of Biochemistry BP 67, Dschang (Cameroun) Tél./Fax (237) 243 691 506 E-mail : 1 Expose BCH327 Année 2020-2021 TABLE DES MATIÈRES INTRODUCTION..........................................................................................................2 I. Principe de la chromatographie en phase gazeuse et de la chromatographie haute performance................................................................3 I.1 Principe de la CPG........................................................................................................................................... 3 I.2 principe de la HPLC........................................................................................................................................ 3 II. Dosage en chromatographie : Exploration des différentes méthodes quantitatifs (méthode comparative).............................................4 II.1 Méthode par étalonnage externe...........................................................................................................5 II.2 Etalonnage interne......................................................................................................................................... 7 II.3 Méthodes des ajouts dosés.......................................................................................................................9 III. Etude de cas n°1 (dosage HPLC Et CPG après traitement préliminaire)............................................................................................................11 III.1 Dosage d'adrénaline plasmatique.....................................................................................................11 III .2 Présentation d'un dosage éthanol par CPG................................................................................14 CONCLUSION..............................................................................................................18 2 Expose BCH327 INTRODUCTION Le terme chromatographie désigne un ensemble de technique basées sur la distribution différentielles des constituants d’un mélange entre une phase stationnaire et une phase mobile ces deux forces exerçant respectivement une force de rétention et une force d’entrainement sur chaque constituants. Un des aspects fondamentaux de la chromatographie est le dosage des molécules biologiques à partie des techniques chromatographique comme la HPLC et la CPG. En fonction des paramétrés maitrises par l’operateur, cette technique se décline en trois sous-ensembles : l’étalonnage externe, l’étalonnage interne et la méthode des ajouts doses. Afin de rendre cette présentation plus pratique nous allons présenter dans un premier temps les différents méthodes de quantification utilisées en chromatographie HPLC et CPG, dans un deuxième temps des exemples d’études de cas utilisant ces différentes méthodes de quantification précisément le dosage de l’éthanol dans le vin en CPG et celui de l’adrénaline dans le sang en HPLC. 3 Expose BCH327 I. PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE ET DE LA CHROMATOGRAPHIE HAUTE PERFORMANCE I.1 PRINCIPE DE LA CPG La chromatographie en phase gazeuse est une méthode de séparation, d'analyse et de dosage des substances volatile. Le principe est le suivant : l'échantillon à étudier circule dans une colonne, entraîné par un gaz vecteur inerte (gaz vecteur utilisé pour cette manipulation est l'hélium). Le mélange à analyser est en contact permanent avec une phase stationnaire qui se trouve sur la paroi interne de la colonne (colonne capillaire) ou remplit (colonne remplit). Par suite de phénomènes d'adsorption ou de dissolution sélective, les diverses constitutions du mélange sont plus ou moins retenu par la phase stationnaire, si bien que chaque constituant évolue dans la colonne avec une vitesse différente. A la sortie de la colonne, on observe donc l'apparition du mélange non pas simultanément, mais avec un décalage caractéristique chacun de ces constituants. Première étape: L'injection du mélange (1 microlitre) à l'aide d'une seringue Deuxième étape: Le mélange est entraîné dans la colonne par le gaz vecteur Troisième étape: Les molécules ont une certaine affinité pour la phase stationnaire de la colonne. Le déplacement de chaque molécule est donc une succession de phases d'adsorption (la molécule est liée à la surface) et de séparation (la molécule est à nouveau entraînée par le gaz vecteur) se déplacent globalement plus vite Quatrième étape: Les molécules arrivent donc par paquet en bout de colonne au d'un temps t'appelé temps de rétention. Le temps de rétention dépend de conditions chromatographie (température, pression, débit de gaz vecteur qui peut donner une réponse qualitative (identification du composé) ou quantitative (dosage). I.2 PRINCIPE DE LA HPLC L’échantillon à analyser est poussée par un liquide (phase mobile) dans une colonne remplie d’une phase stationnaire de fine granulométrie(les grains sont de très petite taille). Le débit d’écoulement de la phase mobile est élevé ce qui entraine une augmentation de la pression dans le système. Ce débit élevé diminue le temps nécessaire pour séparer les composants le long de la phase stationnaire. La fine granulométrie de la phase stationnaire permet une meilleure séparation des composants. En effet, pour un 4 Expose BCH327 même volume de la phase stationnaire la surface d’échange augmente si les grains qui la composent sont de diamètre plus petit. Les pics obtenus sont plus étroits donc la résolution est améliorée, le seuil de détection est également plus bas. La combinaison de ces attributs – rapidité et résolution élevée – conduit à l’appellation « haute performance ». II. DOSAGE EN CHROMATOGRAPHIE : EXPLORATION DES DIFFÉRENTES MÉTHODES QUANTITATIFS (MÉTHODE COMPARATIVE) Parallèlement à ces méthodes de quantification que l’on peut qualifier de relativement absolues, il existe un autre concept de quantification qui consiste à comparer une valeur induite (bien souvent un signal électrique à une échelle externe. En fonction des paramètres maîtrisés par l’opérateur, cette technique se décline en trois sous-ensembles : - L’étalonnage externe - L’étalonnage interne - La méthode des ajouts dosés Le premier avantage de ces techniques comparatives est de s’affranchir d’un certain nombre de paramètres de réglage des appareillages. En effet, dans tous les cas, on va mesurer un signal électrique ou un signal optique d’amplitude faible (des µ volts, des µ intensités de faisceau lumineux…) : Il sera donc nécessaire, dans un premier temps d’amplifier ce signal et, qui dit amplification, dit gain, dit réglage d’un gain optimum. En fonction de paramètres physiques (vétusté des sources lumineuses, encrassement des sources de détection…) le gain optimum peut conduire à des réglages différents. Par les techniques comparatives, on s’affranchit de ces paramètres que l‘on peut qualifier d’internes à la machine. On fera toutefois attention de ne pas les modifier en cours d’analyse. Hormis ces paramètres liés aux réglages de la machine’, un certain nombre de paramètres peuvent être liés à la loi de réponse de la technique. Ainsi, en transmission optique (absorption moléculaire, absorption atomique, émission…), il existe une relation simple entre l’intensité du rayonnement incident et celle du rayonnement transmis, du type 5 Expose BCH327 d= log10 I0 / It = k l C Expression dans laquelle Io et It représentent les intensités des rayonnements incidents et transmis, la longueur du trajet optique, C la concentration en espèce analysée et k un facteur de proportionnalité lié à la technique utilisée et propre au soluté analysé. Dans certains cas, l’opérateur maîtrise la valeur et la constance de l (cas de l’absorption moléculaire en cuves, de l’absorption atomique…Dans ce cas, le produit k*l reste constant, et il existe une relation linéaire simple entre le signal et la concentration. L’opérateur pourra alors utiliser une technique d’étalonnage externe. Dans d’autres domaines, la chromatographie, l’absorption moléculaire en film…, l’opérateur ne maîtrise pas obligatoirement la quantité d’échantillon injectée dans l’appareil (l’épaisseur du film dans le cas de l’absorption), la réponse n’est donc pas simplement proportionnelle à la concentration. Il s’affranchît de ce problème en utilisant une technique d’étalonnage interne. Enfin, il peut, par souci d’économie de temps, être amené à utiliser la méthode des ajouts. II.1 MÉTHODE PAR ÉTALONNAGE EXTERNE C’est une technique qui consiste à comparer les surface des pics du mélange avec un étalon prise comme référence alors dans certaine technique ils n’est pas possible de maintenir constant un paramètre analyse. Ce qui est notamment en chromatographie en phase gazeuse ou on ne connait pas précisément le volume échantillon injecte dans la chromatographie. Donc on s’affranchit de cette méconnaissance en introduisant dans échantillon a analysé une substance en quantité connue. Dans tous les cas, la technique comporte trois phases : - La réalisation d’une courbe d’étalonnage à partir de solutions de concentrations connues - La mesure du paramètre sur l’échantillon inconnu - La comparaison de la mesure à la courbe d’étalonnage. Elle est applicable en méthode directe, si le soluté est lui-même coloré ou absorbe dans le domaine considéré et en méthode indirecte (introduction d’un chromophore) si le soluté est transparent dans le domaine considéré. L’exemple de la détermination du phosphore soluble dans les sols (norme NF X 31- 161)10 illustre cette technique (après dérivatisation). 6 Expose BCH327 En présence de réactif sulfomolybdique, le phosphore forme un complexe coloré qui absorbe fortement dans le rouge ( à 825 nm). Cette absorption moléculaire obéit à la loi de Beer-Lambert (d = log10 I0/It = l C), expression dans laquelle représente une   constante appelée le coefficient d’extinction molaire, l le trajet optique (épaisseur de la cuve = 1 cm dans le cas présent) et C la concentration. Courbe d’étalonnage A partir d’une solution mère d’ortho phosphate d potassium à 450 mg par litre, on prépare une gamme de quatre solutions étalons respectivement à 0 ; 2,25, 4 et 9 mg /l par prélèvement de volumes de solution mère adéquate et dilution à 1000 avec de uploads/Management/ expose-de-chromatographie.pdf