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Immunofluorescence PRINCIPE  Reconnaissance d’une protéine produite par le bio

Immunofluorescence PRINCIPE  Reconnaissance d’une protéine produite par le bio- agresseur, appelée antigène, par une protéine produite en laboratoire appelée anticorps qui est spécifique à l’agent recherché.  Pour la révélation, une protéine fluorescente est liée à un second type d’anticorps. La protéine fluorescente émet de la lumière lorsqu’elle est exposée à une certaine longueur d’onde.  La lecture s’effectue à l’aide d’un microscope à fluorescence.  Si l’agent n’est pas présent, il n’y a pas émission de couleur, car les anticorps ne se sont pas fixés. Immunofluorescence directe :  Dans cette technique, la protéine fluorescente, appelée fluorochrome n’est pas couplée à un anticorps secondaire, mais sur l’anticorps primaire. Ce dernier est spécifique (anticorps monoclonal) au bioagresseur.  Cette technique présente néanmoins un désavantage conséquent. En effet, il existe peu de sites de fixation sur le bioagresseur, donc peu d’anticorps peuvent se lier. Cela a pour consé- quence de générer une faible intensité lumineuse. Immunofluorescence indirecte :  Pour pallier aux problèmes d’intensité lumineuse, l’immunofluorescence indirecte est préférée.  Dans cette technique, un anticorps primaire monoclonal se fixe sur le bioagresseur. Ensuite, un anticorps secondaire polyclonal qui possède une forte affinité pour l’anticorps primaire est ajouté. Les anticorps primaires présentent différents sites de fixation. Plusieurs anticorps secondaires peuvent donc s’y lier, ce qui décuple ainsi l’intensité lumineuse.  C’est aussi une technique moins onéreuse que l’immunofluorescence directe. Les anticorps primaires, directement marqués par un fluorochrome, sont limités sur le marché et très chers. Inconvénients : Cette technique est rapide, fiable et plutôt abordable en termes de coûts. Cependant, certains inconvénients existent. • Faux positif ou faux négatif : le résultat obtenu n’est pas conforme à la réalité. Pour limiter les faux positifs, un témoin négatif est effectué avant analyse. Pour ce faire, les anticorps secondaires sont mis en présence du bioagresseur. Après lavage, il ne doit pas y avoir de fluorescence émise. En effet, les anticorps secondaires n’étant pas spécifiques au bioagresseur, ils ne peuvent s’y fixer. Néanmoins, les analyses sont généralement doublées, pour limiter les problèmes de faux résultats. L’obtention de deux résultats permet une comparaison. • Photo-blanchiment : les molécules fluorescentes utilisées peuvent arrêter d’émettre de la fluorescence et ainsi fausser les résultats. L’utilisation de matériel à haute résolution et haute sensibilité atténue ce phénomène. • Après les 12h d’incubation, un lavage est nécessaire afin éliminer toutes les molécules non fixées. Remarque : Cette technique est très proche de la technique Elisa. Il s’agit de deux techniques de sérologies basées sur la reconnaissance antigène-anticorps, le bioagresseur jouant le rôle d’antigène. La seule différence entre elles est la révélation et la lecture des résultats : le test Elisa utilise une méthode de colorimétrie tandis que l’immunofluorescence utilise une méthode de fluorescence. I. Application de l’immunofluorescence en dermatologie :  La diversité des maladies de la peau couvre l’ensemble des disciplines et spécialités médicales. L’application de la technique d’immunofluorescence directe (IFD) aux biopsies cutanées pour y rechercher des motifs antigéniques cellulaires ou tissulaires a permis d’améliorer le diagnostic des maladies bulleuses , des maladies auto-immunes et des vascularites.  Le principe de la technique consiste à déposer un anticorps spécifique de l’antigène recherché sur la lame de biopsie cutanée coupée en congélation. Pour visualiser le complexe antigène + anticorps, on utilise un colorant fluorescent (fluorochrome) qui prend une couleur verte ou rouge à l’examen au microscope équipé d’une lampe UV.  La congélation immédiate du tissu biopsié est nécessaire pour préserver les sites antigéniques que les fixateurs usuels dénaturent. Les cinq anticorps utilisés en routine détectent l’IgA, l’IgG, l’IgM, le C3 et le C1q. II. L’immunofluorescence directe (IFD) cutanée : II.1. Définition  L’immunofluorescence directe est une technique de marquage immuno-histochimique, qui consiste à révéler des motifs antigéniques, présents sur une structure cellulaire ou tissulaire, par application d’anticorps (AC) spécifiques du motif antigénique à révéler, rendu préalablement fluorescents par couplage à un fluorochrome.  Les (AC) se fixent sur l’antigène (Ag) et persistent après lavage de la préparation.  Les cinq anticorps utilisés en routine détectent les Ig A, les Ig G, les Ig M, les C1q et les C3.  Il faut opposer l’immunofluorescence directe à l’immunofluorescence indirecte (IFI), qui s’effectue à partir d’un sérum du malade à la recherche d’anticorps circulants. II.2. Principes de la réaction d’immunofluorescence directe (IFD) cutanée : L’immunofluorescence directe cutanée fait intervenir deux acteurs principaux: les motifs antigéniques recherchés sur la biopsie cutanée et les anticorps spécifiques marqués qui servent à leurs identifications. II.3. Marqueurs fluorescents ou fluorochromes :  Les fluorochromes sont des substances qui, excitées par la lumière ultraviolet (UV), émettent un rayonnement fluorescent visible. Ils sont couplés de façon covalente à l’anticorps spécifique et permettent, ainsi, de repérer le site de fixation de l’anticorps sur le motif antigénique recherché. Le microscope à fluorescence montre les motifs du tissu examiné grâce à un discret phénomène d’auto-fluorescence tissulaire, mais le motif antigénique où s’est fixé l’anticorps fluorescent apparaît beaucoup plus brillant et plus net (contraste net entre l’Ag recherché et le tissu voisin).  Les deux fluorochromes les plus utilisés sont l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) qui donne une fluorescence jaune verdâtre à 517 nanomètres, et l’isothiocyanate de rhodamine (RITC) qui donne une fluorescence rouge orangée à 580 nanomètres. II.4. Types de l’immunofluorescence directe (IFD) cutanée : L’IFD peut être à une ou plusieurs couches :  L’IFD à une couche : l’anticorps (AC), révélant le motif antigénique recherché, est lui-même marqué par la fluorescéine.  L’IFD à deux couches : l’anticorps révélant le motif antigénique n’est pas marqué, il est révélé par un deuxième anticorps lui-même marqué par la fluorescéine  La méthode sandwich : destinée à objectiver un AC fixé dans un tissu, utilise dans un premier temps, l’antigène spécifique à cet AC qui se fixe sur lui, et dans un deuxième temps, les anticorps marqués révélateurs spécifiques de cet antigène.  Le double marquage utilise simultanément deux anticorps différents de spécificité distincte, l’un marqué à la fluorescéine, l’autre à la rhodamine. Figure 2 : Schéma des types de l’IFD cutanée. II.5. Difficultés de la technique : Le marquage doit être spécifique. On doit donc :  Faire des témoins/contrôles négatifs et positifs pour s’en assurer,  Etablir la spécificité de l’anticorps par des témoins : l’anticorps doit identifier une seule molécule, avoir une bonne affinité pour les tissus.  Accéder aux sites antigéniques qui sont rares et enfouis dans les tissus. (méthodes de démasquage des sites antigéniques).  Préserver les sites antigéniques. II.6. Sensibilité de l’IFD et contrôle positif :  La sensibilité de l’IFD est définie par la quantité minimale de motifs antigéniques pouvant être détectée par cette technique. Une bonne sensibilité de l’IFD cutanée dépend de différents facteurs:  respect du site approprié de la biopsie,  fixation et transport correct de l’échantillon,  technique rigoureuse  et lecture des lames sans retard. Des difficultés dans l’une de ces étapes peuvent causer la survenue d’IFD « faux-négatives »  En pratique, il est indispensable de posséder un contrôle positif qui permet d’évaluer la sensibilité de chaque expérience. En IFD, le meilleur contrôle est interne, représenté par des cellules de la peau normale adjacente connues pour exprimer l’antigène recherché, sinon, une coupe d’un autre tissu contenant le motif antigénique peut également être utilisé. II.7. Spécificité de l’IFD et contrôle négatif :  Elle correspond à la détection réelle du motif antigénique recherché. Elle doit être soigneusement vérifiée, car il existe plusieurs causes de réactivités faussement positives (fluorescences parasites).  La vérification de la spécificité de l’IFD, ou contrôle négatif, est très importante mais quelques fois difficile à obtenir.  La méthode la plus rigoureuse est la pré-incubation de l’anticorps spécifique avec l’antigène purifié qui doit abolir l’immunoréactivité de l’anticorps utilisé ensuite dans la réaction d’IFD. Cette méthode étant très difficilement réalisable, on se contente en pratique de la substitution de l’anticorps spécifique avec un antisérum non immun, ce qui doit conduire également à une absence de réactivité. II.8. Inconvénients de l’IFD cutanée : L’IFD cutanée présente quelques inconvénients auxquels on pourrait remédier :  Nécessité d’utiliser des tissus frais et congelés.  Décroissement rapide de la fluorescence lors de l’exposition des coupes à la lumière UV, peut être partiellement palliée par l’utilisation de milieux de montage spéciaux contenant des agents antioxydants, comme la p-phénylène diamine ou le n propylgallate.  Absence d’examen histologique conventionnel de la coupe, auquel on peut remédier par la coloration de la coupe congelée par l’hématoxyline-éosine-safran. Mais la qualité des coupes obtenues après fixation dans le liquide de formol reste meilleure, d’où la pratique simultanée de l’histologie conventionnelle et de l’IFD.  Présence relativement fréquente, au sein des tissus, de substances fluorescentes pouvant être confondues avec la fluorescence spécifique. Une contre collaboration au bleu d’Evans efface en grande partie ces fluorescences parasites.  Coût élevé. uploads/Management/ immuno-fluorescence.pdf