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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUP

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE HASSIBA BENBOUALI DE CHLEF FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE DEPARTEMENT DE BIOLOGIE Le Théme d’exposé La chromatographie L2 Méthodologie Réalisé par : Groupe : ELAIEIDA Halima . 04 KOUIDRI ZOURGUI Nour el houda . KOUIDER Chaima . GUIMOUR Aya . 04 HAMIDCHA Nihel . 04 A. Définition de la chromatographie : La chromatographie est une méthode séparative qui permet l'identification et le dosage des différents composés d'un mélange. Le principe est basé sur les différences d'affinité des composés du mélange avec la phase stationnaire et la phase mobile. Le chromatogramme traduit la variation du soluté dans l'éluant en fonction du temps. Il existe différents types de chromatographie suivant la méthode de séparation utilisée : - d'adsorption - de partage - d'échange d'ions - d'exclusion Abréviations des 3 grandes familles de chromatographie CPG : chromatographie en phase gazeuse HPLC : chromatographie liquide haute performance CCM : chromatographie sur couche mince Cette méthode d'analyse permet l'identification et le dosage de composés dans un mélange. Elle peut-être couplée à un spectromètre de masse pour l'identification de composés inconnus. Pour l'exploiter pleinement il est important de connaitre les différentes grandeurs de rétention et d'utiliser des colonnes avec une bonne efficacité. La chromatographie permet également d'effectuer des dosages avec une grande précision. Les principales méthodes de dosage sont la normalisation interne, la méthode des ajouts dosés et l'étalonnage interne. L'étalonnage externe peut également être effectué sous certaines conditions. Schéma d'une chromatographie sur papier. B. Classification : On peut classer les méthodes chromatographiques d'après la nature des phases utilisées ou celle des phénomènes mis en oeuvre dans la séparation. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successives sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase. Phase mobile et phase fixe : La phase mobile en chromatographie peut être :  soit un gaz (chromatographie en phase gazeuse), la phase mobile est alors appelée gaz vecteur ou gaz porteur ;  soit un liquide (chromatographie sur papier, couche mince ou colonne), la phase mobile est alors appelée éluant. La phase fixe peut être solide ou liquide. Les solides, silice ou alumine traitées, permettent la séparation des composants des mélanges grâce à leurs propriétés adsorbantes. Ils peuvent être employés comme remplissage d'une colonne (chromatographie par gravité et chromatographie à haute performance ou HPLC) ou étalés en couche mince sur une plaque de verre, d'aluminium ou sur une feuille de matière plastique (chromatographie sur couche mince ou CCM). La phase fixe peut aussi être constituée par un liquide imprégnant un support solide ou encore par une chaîne carbonée fixée sur un support (phase greffée). Ainsi en chromatographie sur papier, la phase fixe est formée par l'eau que les molécules de cellulose du papier adsorbent, alors qu'en chromatographie en phase gazeuse, elle est constituée d'un liquide peu volatil et thermiquement stable imprégnant un granulé poreux. C. Principe : La chromatographie repose sur l'entraînement d'un échantillon dissous par une phase mobile à travers une phase stationnaire. Celle-ci retient plus ou moins fortement les substances contenues dans l'échantillon dilué selon l'intensité des forces d'interactions de faible énergie (comme les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène, etc.) réalisées entre les différentes espèces moléculaires et la phase stationnaire. Les différents composants de l'échantillon ont généralement une vitesse caractéristique qui permet de les séparer, voire de les identifier. Cette vitesse de séparation est fortement dépendante de la nature de la phase mobile et de la phase stationnaire. Souvent, l'échantillon est analysé par comparaison avec des substances déjà connues dans l'échantillon ou par comparaison avec les résultats de l'analyse d'une solution- étalon (solution commerciale contenant des substances connues, à des concentrations bien connues). Ces substances servent de références et permettent d'identifier ou de doser chaque espèce par comparaison des vitesses de séparation (et éventuellement d'autres renseignements donnés par la détection). Il s'agit de chromatographie analytique. Dans d'autres cas, on se contente de purifier et séparer les fractions, de les récolter pour les identifier par d'autres techniques : c'est la chromatographie préparative. Cette méthode d'analyse permet l'identification et le dosage de composés dans un mélange. Elle peut-être couplée à un spectromètre de masse pour l'identification de composés inconnus. Pour l'exploiter pleinement il est important de connaitre les différentes grandeurs de rétention et d'utiliser des colonnes avec une bonne efficacité. La chromatographie permet également d'effectuer des dosages avec une grande précision. Les principales méthodes de dosage sont la normalisation interne, la méthode des ajouts dosés et l'étalonnage interne. L'étalonnage externe peut également être effectué sous certaines conditions. Il existe de nombreux types de chromatographie ; on peut notamment les classer selon la nature de la phase mobile :  la chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC en anglais)  la chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC en anglais) également appelée CPV (chromatographie en phase vapeur)  la chromatographie en phase liquide (CPL ou LC en anglais)  la chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP ou HPLC en anglais)  la chromatographie en phase supercritique (CPS ou SFC en anglais). On peut aussi les nommer selon les interactions développées par la phase stationnaire :  la chromatographie d'adsorption/d'affinité  la chromatographie de partage  la chromatographie à échange d'ions  la chromatographie chirale (qui est, soit de la CPG, soit de la CPL)  la chromatographie d'exclusion stérique (CES ou SEC en anglais) ; Ou selon le support de la phase stationnaire :  la chromatographie sur colonne (regroupant notamment HPLC et CPG) : la phase stationnaire est dans un tube étroit et la phase mobile progresse par gravité ou différence de pression  la chromatographie planaire (qui recouvre CCM et chromatographie sur papier) : la phase stationnaire est sur la surface d'un support plat (CCM) ou dans une feuille de cellulose poreuse (chromatographie papier) et la phase mobile se déplace par capillarité ou par gravité. Étapes d'une analyse quantitative Choix de la méthode  Analytes à étudier : nature et nombre Connaître la nature de l'analyte permettra d'adapter le détecteur en sortie de l'analyse chromatographique. (Gaz, liquide...) Enfin Connaître son nombre c'est à dire sa concentration permettra d'éviter la saturation du détecteur. Il existe en chromatographie, différents détecteurs (FID, Spectro...) 1. Analytes à étudier :  Nombre d’analyses  Exactitude recherchée 2. Échantillonnage 3. Préparation de l’échantillon :  Mise en solution  Extraction des analytes de l’échantillon  Concentration  Rendement de l’extraction 4. Éliminer les interférences :  Effet de matrice  Purification de l’extrait 5. Analyse chromatographique :  Directe  Après traitement (méthylation, sylilation…)  Étalonnage  Linéarité 6. Calcul des résultats :  Exactitude  Evaluation d’incertitude D. Types de chromatographies : La chromatographie en phase gazeuse (CPG) : la phase mobile est un gaz, dit gaz vecteur, et les solutés sont introduits sur la colonne directement s’il s’agit d’un échantillon gazeux ou après volatilisation dans la chambre d’injection chauffée s’il s’agit d’un échantillon liquide (éventuellement après dilution ou dissolution dans un solvant adéquat) ; La chromatographie en phase liquide (CPL) : la phase mobile est constituée d’un solvant pur ou le plus souvent d’un mélange plus ou moins complexe de solvants de grande pureté ; elle est introduite sur la colonne à débit constant par un système de pompage ; La chromatographie en phase supercritique (CPS) : la phase mobile est un fluide supercritique, c’est-à-dire porté au-delà des coordonnées en pression et température du point critique, point à partir duquel il n’existe plus de frontière définie entre les états liquide et gazeux. Suivant l'état physique de la phase stationnaire, on distingue : La chromatographie liquide/solide (CLS) La chromatographie liquide/liquide (CLL) La chromatographie gaz/solide (CGS) La chromatographie gaz/liquide (CGL) Suivant le mécanisme de rétention: cette classification repose sur la nature de la phase stationnaire et son interaction avec les molécules à séparer. On distingue ainsi: la chromatographie d'adsorption, de partage, d'échange d'ions, d'exclusion et la chromatographie d'affinité. Selon la technique mise en jeu, on distingue: la chromatographie sur colonne, la chromatographie de surface (chromatographie sur papier ou chromatographie sur couche mince). Type Critère de séparation Adsorption Polarité Partage Solubilité Exclusion Taille des molécules Échangeuse d’ions Charge ionique Affinité Structure des protéines E. Chromatographie sur couche mince (CCM) : 1.Définition et appareillage: La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes d'adsorption : la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d'une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou d'aluminium. Après que l'échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant. Les principaux éléments d'une séparation chromatographique sur couche mince sont: la cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle étanche. la phase stationnaire : uploads/Management/ methodologie 4 .pdf