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ACCRÉDITATION EN BACTÉRIOLOGIE REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2014

ACCRÉDITATION EN BACTÉRIOLOGIE REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2014 - N°461 // 37 article reçu le 19 décembre, accepté le 26 février 2014. © 2014 – Elsevier Masson SAS – Tous droits réservés. RÉSUMÉ La coloration de Gram qu’elle se fasse manuellement ou grâce à un colo- rateur est une étape incontournable mais aussi critique en bactériologie qui contribue à la fois au diagnostic clinique et à l’orientation thérapeutique. Il s’agit d’une méthode en portée A de type qualitatif. L’objectif de ce travail est de contribuer à répondre aux exigences de la norme ISO 15189 en termes de vérification des performances, d’harmoni- sation des pratiques professionnelles et d’évaluation des compétences en respectant le formalisme du document SH FORM 44. L’analyse des risques est décisive qu’elle se fasse selon la méthode des 5 M ou par l’analyse des modes de défaillance, de leurs effets et de leur criticité et doit aboutir à la mise en place de moyens cohérents de maîtrise adaptés à sa propre pratique. Sur site, l’étude des performances a consisté à évaluer la conta- mination entre échantillons (n = 12, le bac de coloration et le carrousel du colorateur ne permettant pas de réaliser plus de 12 colorations de Gram simultanées) et à comparer la coloration manuelle versus la coloration automatisée sur système PREVI Color de bioMérieux, sur 20 échantil- lons de contrôles. Les critères d’acceptabilité ont porté sur la coloration (Gram positif, Gram négatif) et la morphologie observée (bacille ou cocci) de 4 souches de référence connues de la Collection de l’Institut Pasteur. En pratique, si la compétence de l’utilisateur reste un point crucial à maî- triser, le biologiste doit aussi pleinement s’impliquer, les normes n’étant pas toujours adaptées, les recommandations des sociétés savantes et la bibliographie restant rares. Coloration de Gram – vériﬁcation sur site/validation des méthodes – SH FORM 44 – norme ISO 15189 – accréditation – gestion des risques. Hélène Astier-Théfennea,*, Audrey Wolfa, Chrystelle Darlesa, Éric Garnotela Vérification des performances d’une méthode selon le SH FORM 44 : application à la coloration de Gram ti l l 19 dé b té l 26 fé i 2014 a Laboratoire de biologie Hôpital d’Instruction des Armées Laveran 34, bd Laveran – CS 50004 13384 Marseille cedex 13 * Correspondance biologie.laveran@gmail.com SUMMARY Veriﬁcation assessment of Gram staining according to SH FORM 44 Gram staining manually made or in a automated way is an inescapable but also critical stage in bacteriology which contributes at the same time to the clinical dia- gnosis and to the therapeutic orientation. It is about a qualitative method in impact A. The aim of this work is to contribute to meet the requirements of the standard ISO 15189 in terms of performances’check, harmonization of the profes- sional practises and evaluation of the skills/know- how by respecting the formalism of SH FORM 44. The risks’analysis is decisive that it makes accor- ding to the 5 M method or by the analysis of the failure modes, their effects and their criticality and has to end in the implementation of coherent means of control adapted to its own practice. On-site, the study of the performances consisted in estimating the contamination between samples (n=12, the stain dish and the carousel of the automated staining system allowing to realize no more than 12 Gram staining simultaneously) and to compare the manual Gram staining versus automated on system PREVI Color de BioMérieux, on 20 samples of controls. The cri- teria of acceptability concerned the staining (positive Gram, negative Gram) and the observed morphology (bacillus or cocci) of 4 reference bacteria known for the Collection of Institut Pasteur. In practice, if the competence of the user stays a crucial point to be mastered, the biologist so completely has to get involved, the recommendations of the standards, the learned societies and the bibliography not being very numerous still and adapted to the microbiology. Gram staining – Veriﬁcation assessment – SH FORM 44 – standard ISO 15189 – accreditation – risk management. 1. Introduction La vérification sur site/validation des méthodes en biologie médicale est une des exigences de la norme NF EN ISO 15189 [1]. En effet, dans le paragraphe 5.5, il est indiqué « Les méthodes et les procédures sélectionnées doivent être évaluées et donner des résultats satisfaisants avant d’être utilisées pour les analyses médicales. ». De plus (paragraphe 5.3), « Il doit être démontré (lors de l’instal- lation et au cours de l’utilisation courante) que le matériel est capable d’atteindre les performances requises et qu’il est conforme aux spéciﬁcations se rapportant aux analyses concernées ». Les méthodes dites reconnues (dispositifs médicaux de diagnostic in vitro marqués CE ou méthodes « fournisseur »), sont a priori validées dans leur domaine d’application 38 // REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES - AVRIL 2014 - N°461 et le laboratoire doit, pour ses méthodes, vérifier qu’elles sont utilisées dans leur domaine d’application, qu’elles corres- pondent aux besoins de ses clients (patients/prescripteurs) et qu’elles sont maîtrisées au sein du laboratoire (« vérifica- tion de méthodes – portée A »). En revanche, le laboratoire doit caractériser les critères de qualité de la méthode et la valider (« validation de méthode-portée B ») dès lors qu’il ne s’agit pas d’une méthode reconnue ou que celle-ci est employée hors de son domaine d’application (modification de la prise d’essai ou de la matrice/milieu biologique,…). L’objectif est donc de vérifier la mise en application d’une méthode dans son environnement propre et de démontrer que la méthode fonctionne correctement dans les conditions opératoires du laboratoire et qu’elle donne des résultats sûrs et fiables pour les patients et les cliniciens, beaucoup de facteurs pouvant affecter ses performances (conditions d’expédition et de stockage des réactifs, conditions ambiantes locales, compétence de l’utilisateur notamment pour les méthodes manuelles…). En bactériologie, les conditions ne sont pas forcément simples car il y a beaucoup de méthodes manuelles, les échantillons de contrôles sont parfois absents, les critères de performance ne sont pas forcément aussi bien défi- nis que pour des méthodes automatisées quantitatives : l’analyse des risques devient alors une étape décisive. Le biologiste a un rôle majeur à jouer. La vérification de la coloration de Gram, technique incontournable en bac- tériologie, est présentée dans cet article. C’est une étape essentielle mais aussi un point critique en bactériologie. Qui n’a pas hésité en lisant un Gram d’une hémoculture ? Qui ne s’est pas trompé dans ce diagnostic ? 2. Quelles sont les informations pertinentes à connaître au préalable ? L’étape de vérification/validation sur site doit être précédée d’une étape préparatoire, véritable travail d’expertise réalisé par le biologiste ou un opérateur habilité. La catégorisation de la méthode est indispensable de façon à appliquer la méthode de validation prévue. r Dans un premier temps, il faut définir le type de ﬂexi- bilité de la méthode (SH REF 08, [2]). - Méthodes « fournisseur » (portée flexible standard A), dites adoptées, avec uniquement une vérification de performances sur site. - Méthodes adaptées ou développées en interne (portée flexible étendue B), avec une validation de méthode. Il est préférable d’adopter chaque fois que cela est pos- sible des méthodes en portée A. Cela peut paraître simple, mais dans le cas de méthodes manuelles, cela ne se limite pas à l’utilisation de réactifs marqués CE ; de plus, le mar- quage CE correspond à une conformité des produits aux directives et à une autorisation de mise sur le marché qui ne correspond pas forcément à un gage de qualité [3]. Il convient aussi de vérifier qu’en pratique la méthode respecte scrupuleusement les informations figurant sur la notice du fabricant. r Puis dans un second temps, il faut connaître le type de méthodes (quantitatif ou qualitatif, manuel ou automatisé). - Les méthodes de type quantitatif fournissent un résultat chiffré. Sont également assimilés au type quantitatif, les examens fournissant un résultat de type qualitatif, extra- polé à partir de la mesure d’un signal continu quantifiable, avec interprétation par rapport à un seuil. - Les méthodes de type qualitatif fournissent un résultat qui n’apporte pas d’information sur la quantité de l’analyte (cellule ou organisme) mais seulement sur sa présence ou son absence (positif/négatif) ou l’identification de la caractéristique recherchée. On classe dans cette catégorie les examens où aucune mesure d’une donnée quantifiable n’est déterminée en continu et ceux dont le résultat est obtenu par l’observation de la réaction, par comparaison avec des témoins positif et négatif notamment. La coloration de Gram en mode (c’est la méthode) manuelle ou automatisée sur le système PREVI Color Gram (bio- Mérieux) est une méthode en portée A de type qualitatif. Dans ce cas, la « validation » correspond à une vérification des performances annoncées par le fabricant et souhaitées par le laboratoire en mode manuel ou du couple automate- réactif, lors de la mise en application dans le laboratoire. r Il faut aussi donner le principe de la méthode (technique de coloration) car cela est abordé dans le SH FORM 44 [4] ainsi que le SH INF 50 [5]. 3. Vériﬁcation sur site (portée ﬂexible A) : les étapes La validation uploads/Management/ validation-methode-coloration-gram.pdf