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Détection des acides nucléiques par hybridation moléculaire Hybridation molécul

Détection des acides nucléiques par hybridation moléculaire Hybridation moléculaire Règles de complémentarité de bases des appariements entre brins d’ADN Purine Pyrimidine Purine Pyrimidine Liaison-H Définition Hybridation moléculaire: c’est l’association entre 2 simples brins d’acides nucléiques d’origine diverse par formation de liaisons-H entre ces deux brins en obéissant à la règle de complémentarité de bases. On distingues les hybridations: • ADN-ADN, • ADN-ARN et • ARN-ARN But: Détecter la présence d’un acide nucléique ayant une séquence donnée (ADN cible), à l’aide un fragment d’ARN ou d’ADN complémentaire marqué (sonde), cette stratégie de marquage des acides nucléiques permet de localiser et/ou quantifier les acides nucléiques (méthodes sensibles). Sonde liaison ADN/ARN (cible) Définition Principe d’hybridation moléculaire Les étapes d’hybridation des acides nucléiques Chaleur pH Principe d’hybridation moléculaire Chaleur pH Les étapes d’hybridation des acides nucléiques Principe d’hybridation moléculaire Chaleur pH Les étapes d’hybridation des acides nucléiques Principe d’hybridation moléculaire Notions Dénaturation= séparation entre 2 brins par rupture des liaisons hydrogènes. Hybridation= Association par formation de liaisons hydrogènes entre 2 brins d’ADN (ARN) au niveau de leurs séquences complémentaire. Tm : température de fusion, température à laquelle 50% des fragments d'ADN d’une séquence donnée sont sous forme simple brin. Principe d’hybridation moléculaire La dénaturation des acides nucléiques se fait par : •Chauffage > Tm •Utilisation d’agents dénaturants. Le ré-appariement de bases se fait par refroidissement progressif ou bien par un lavage du milieu si des agents dénaturants sont utilisés. Tm = 4 X (G+C) + 2 X (A+T) G,C, A, T : nucléotides composant de la séquence de l’oligonucléotide. Température optimale de dé-hybridation = Tm + 25 °C Différentes stratégies d’hybridation moléculaire L’ADN double brin est placé dans un milieu liquide contenant du Formamide (agent dénaturant). Après lavage, on rajoute la sonde à une forte concentration. L’application de l’agitation à une température donnée permet l’hybridation des deux fragments. 1- Hybridation sur phase liquide Différentes stratégies d’hybridation moléculaire La vérification du processus d’hybridation se fait par différentes méthodes: •Mesure de la densité optique (DO) par spectrophotométrie. •Chromatographie sur colonne d’hydroxylapatite (HAP), elle permet la séparation entre les hybrides des simples brins. 1- Hybridation sur phase liquide dans ce cas, la séquence d’acide nucléique (séquence cible) est immobilisée sur un support solide. Cette stratégie facilite la séparation entre les fractions hybridées et les non-hybridées. Cependant, le temps d’hybridation est beaucoup plus long que lors de l’hybridation en phase liquide. Différentes stratégies d’hybridation moléculaire 2- Hybridation sur support solide Différentes stratégies d’hybridation moléculaire Les principaux support utilisés pour l’hybridation des acides nucléiques sont les membranes de nitrocellulose , des membranes synthétiques à base de Nylon ou sur des cultures en colonies de bactéries. Exemples : les techniques de Southern Blot et Northern Blot. 2- Hybridation sur support solide C’est une méthode cytogénétique qui permet de marquer à l’aide des sondes, des séquences d’acides nucléiques connues, et ainsi de les mettre en évidence sur des cellules ou tissus spécifiques. Différentes stratégies d’hybridation moléculaire Les principales applications de l’hybridation in-situ sont: la localisation sur les chromosomes des régions comportant des gènes, vérification de l’incorporation par des bactéries d’un plasmide ou d’un phage recombinant, diagnostic des infections virales…etc. Exemple : la technique FISH (Fluorescent In Situ Hybridization). 3- Hybridation in-situ Merge ARN viral (VIH-1) Protéine hn RNP A1 0h 3h 6h 12h 24h Les différentes stratégies d’hybridation moléculaire Exemple : détection de la co-localisation cellulaire de l’ARN viral du VIH- 1 avec la protéine hnRNP-A1. Temps post- infection Les sondes Marquage des acides nucléiques: correspond à l’introduction d’un marqueur sur une séquence d’acide nucléique (ARN ou ADN) afin de pouvoir suivre les propriétés d’une séquence complémentaire par la révélation de signaux émis à partir de ces marqueurs sur des instruments de mesure. Il existe différents types de marquage: radioactif, fluorescent, enzymatique et luminescent. Les séquences d’acides nucléiques marquées sont appelées : sondes. Les sondes La sonde nucléique: c’est une séquence monobrin d’environ 30 nucléotides d’ADN ou d’ARN marquée par un composant fluorescent ou luminescent, un radio-isotope, ou une enzyme, que l’on utilise pour détecter les propriétés des séquences complémentaires par diverses techniques d’hybridation in-vitro ou bien in-situ. Les sondes sont générées in-vitro à partir de la séquence complémentaire à la séquence à analyser (ADN ou ARN cible). La génération se fait par différentes méthodes: -Fragments issus de la digestion par des enzymes de restriction. -Produits d’amplification de gènes par PCR. -Synthèse commerciale. Les sondes Agents de marquage des acides nucléiques 1- les isotopes radioactifs (Sondes chaudes) Le Phosphate -32 (32P), le Soufre-35 (35S), le Tritium-3 (3H). L’incorporation de la radioactivité dans la séquence se fait par moyen enzymatique à l’aide des nucléotides triphosphate radio-marqués. En pratique : le marquage des acides nucléiques au radio-isotope 32P est le plus utilisé pour le marquage radioactif des sondes. Il émet des rayonnements β de forte énergie qui sont transférable sur des films photographiques lors de l'autoradiographie. 1- les isotopes radioactifs (Sondes chaudes) Les sondes Exemple de transfert de radioactivité sur un film photographique Les sondes Utilisation des isotopes radioactifs (Sondes chaudes) Avantage La durée de vie des marqueurs radioactifs est très courte. Environ 15 jours pour le 32P. La gestion des déchets radioactifs est compliquée. Il existe des restrictions administrative à son utilisation. Inconvénients: La manipulation de la radioactivité représente un grand danger pour l'utilisateur. Techniques efficace et très sensible (permet de détecter de faible quantités de cible). Dans ce cas, la détection des acides nucléiques par les sondes froides est basée sur une réaction enzymatique qui fait apparaitre un produit coloré ou fluorescent ou bien luminescent. Exemple : nombreux marqueurs fluorescents utilisés: fluorosceine, Cy5, Cy3, Texas red …etc. A- Marquage direct Le nucléotide comportant le marqueur est directement incorporée au cours de la synthèse du fragment marqué (sonde). Les sondes 2- Marqueurs non-radioactifs: (sondes froides) A- Marquage indirect Dans ce cas le nucléotide est marqué par un substrat qui est révélé ultérieurement par ajout d’une molécule de reconnaissance émettrice du signal de détection. Exemple : la digoxigénine: (DIG) Les sondes dCTP Étape de synthèse de la sonde incorporant des dCTP liée à DIG Révélation avec un anticorps anti-DIG couplé à la fluoresceine ou Cy5 Les sondes Exemple : la digoxigénine: (DIG) Marquage Révélation Sondes chaudes Isotopes radio-actifs (3H, 32P, 35S) Autoradiographie Sondes froides Marqueurs fluorescents Microscopie à fluorescence Biotine, Digoxygénine (DIG) Avidine, streptavidine ou anticorps marqués Enzymes (phosphatase alcaline) Substrats chromogènes Les sondes nucléiques Les méthodes de révélation varient en fonction des marqueurs utilisés La technique de Southern Blot Cette technique a été développée par Edwin Southern, elle permet de détecter la présence d’une séquence spécifique d‘un ADN. Elle est basée sur le principe d’hybridation sur support solide. Elle consiste à faire transférer l’ADN à détecter d’un gel d’agarose vers une membrane (nitrocellulose ou Nylon). Objectif: détecter la présence d’acides nucléiques d’une séquence donnée par utilisation d’un fragment d’ADN complémentaire radio-marqué (sonde). Etapes de la méthode La technique de Southern Blot 1) Extraction de l'ADN génomique double brin à analyser (exemple ADN génomique humain). Une quantité assez importante est requise (5-10 µg). 2) Digestion de cet ADN double brin par des enzymes de restriction. 3) Séparation des fragments par électrophorèse sur gel d’agarose. 4) Dénaturation de l’ADN par traitement avec de la soude, on obtient de l’ADN simple brin. 5) Transfert des fragments de restriction dénaturés sur une membrane d'hybridation: ➔ le transfert s'effectue par capillarité. La technique de Southern Blot Plaque en verre Poids Plaque en verre de support Récipient Tampon de transfert (0.4M NaOH) papiers Papiers whatman Membrane Nylon Gel d’agarose contenant l’ADN Papiers whatman inondé dans le tampon de transfert Papiers whatman 9) révélation de l'hybridation: selon le marqueur utilisé. La technique de Southern Blot 6) Fixation de l'ADN sur la membrane d'hybridation: pour empêcher les brins complémentaires de se ré-hybrider une autre fois par -formation de liaisons H. 7) Hybridation: ajout de la sonde radio-marquée. 8) Lavages: pour éliminer l'excès de sonde non-hybridée et faire détacher de la membrane les mauvais appariements (faux positifs). La technique de Southern Blot Transfert de l’ADN par capillarité filtres Hybridation avec 1 sonde (ARN ou ADN) Digestion avec enzymes de restriction ADN Solution alcaline Nitrocellulose Autoradiographie Électrophorèse La technique de Southern Blot Gel d’électrophorèse marqué au BET Film d’un résultat de Southern Blot après marquage avec une sonde de la b Tubuline La technique de Northern Blot Northern Blot: consiste à l’hybridation des ARNs sur une membrane (nitrocellulose ou Nylon). Extraction des ARNs Électrophorèse sur gel d’agarose en présence de formaldehyde (agent dénaturant). Transfert sur membrane de Nylon ou Nitrocellulose. Hybridation de la sonde marquée 32P. Lavage Révélation par autoradiographie. Etapes de la technique Procédure: même principe que le Southern (transfert d’un gel vers membrane). La technique de Northern Blot Exemple: Structures secondaires de l’ARNr 16S Applications: Analyse de l’expression de gènes. Recherche des variants d’ARNm épissés. La technique de Northern Blot X RNA X Sels (3M NaCl) X RNA La technique de Northern Blot ARNs totaux Transfert par capillarité de l’ARN filtres Hybridation avec 1 sonde (ARN ou ADN) Nitrocellulose Autoradiographie Électrophorèse Exemple: Northern Blot révèle l’augmentation de l’expression d’ARNm de uploads/Marketing/ hybridation-moleculaire-acides-nucleiques.pdf