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Université Abdelmalek Essaadi Faculté des Sciences et Techniques d’Al Hoceima M

Université Abdelmalek Essaadi Faculté des Sciences et Techniques d’Al Hoceima Master Sciences et Techniques : Génie du Littoral - Gestion Environnementale et Développement Durable – Module: écotoxicologie BIOMARQUEURS DE DOMMAGE : GÉNOTOXICITÉ Demandé par : Prof. Hossain El Ouarghi Réaliser par : Younes OUBAKI Abderrahim AARAB PLAN 1- Choix de la méthode (justification); 2-Type de méthode (quantitative, qualitative...) 3- Principe de mesure 4- Matériels et réactifs utilisés et Mode opératoire 5- Représentation des résultats et leur signification 6- Application des biomarqueurs de génotoxicité chez la dreissène 7- Conclusion et critique de méthode 1- Choix de la méthode (justification) : Les bio-marqueurs de dommages traduisent une atteint biologique plus ou moins importante pouvant conduire à une incapacité pour l’individu de se reproduire voire de vivre. Les principaux biomarqueurs de dommages sont des marqueurs moléculaires (cortisol, stress oxydant, peroxydation des lipides…), des marqueurs de génotoxicité (adduits à l’ADN, micronoyaux et test comète), des marqueurs subcellulaires et cellulaires (marqueurs immunologiques), des marqueurs cytologiques et des marqueurs physiologiques. Ces bio- marqueurs de dommages permettent d’obtenir une bonne évaluation de l’état de santé des individus d’une espèce donnée. 2- Type de méthode : Dans cette étude en a choisi la méthode des marqueurs de génotoxicité qui peut induire l'apparition en cas cade d'une série d'événements génétiques: altération de la structure de l'ADN, expression de dommages subis par la synthèse de produits géniques mutants, pathologies associées à ces dommages. La détection et la quantification de certains de ces événements permettent de les considérer comme des biomarqueurs d'exposition et d'effets chez les organismes exposés aux agents génotoxiques dans l'environnement. Alors en peut dit que cette méthode est quantitative. 3- Principe de mesure Les méthodes développées pour évaluer la génotoxicité sont basées sur la mesure directe ou indirecte:  des altérations de structure de l'ADN  de l'activité réparatrice de l'ADN (capacité de l'ADN à réparer les altérations de structure subies)  des mutations apparues dans l'ADN 4- Matériels et réactifs utilisés et mode opératoiree Le suivi des altérations structurelles et/ou fonctionnelles de l'ADN est un outil informatif des niveaux d'exposition voire d'effet dans le cadre d'une démarche d'évaluation des risques écotoxicologiques. L'évaluation de la génotoxicité peut être divisée en 2 approches : la première repose sur la mise en œuvre d'essais bactériens, tels que le test d'Ames, le SOS chromotest et le SOS/umu test ; la deuxième est basée sur l'utilisation d'essais sur organismes et plantes aquatiques, tels que la mesure d'adduits par post marquage au 32P, l'essai micronoyau, le test Comet et l'élution alcaline. Ces derniers ont l'avantage de pouvoir être réalisés au laboratoire ou avec des organismes directement prélevés sur un site contaminé. L'utilisation des essais sur bactéries reste encore aujourd'hui largement privilégiée pour évaluer la génotoxicité des eaux de surface et en particulier leur pouvoir mutagène. Mais les études d'évaluation du risque écotoxicologique se doivent de considérer l'impact génotoxique sur des espèces d'intérêt écologique. C'est pourquoi, de nombreuses méthodes permettant d'évaluer cet impact directement sur les organismes ont été développées et validées. Elles ont aujourd'hui une place importante dans les programmes de surveillance de la qualité du milieu aquatique. Dans cette partie, seules les techniques utilisées sur les organismes aquatiques, et plus particulièrement les invertébrés, dans le cadre de biosurveillance environnementale ou d'évaluation des risques sont présentées. Pour les invertébrés, des tableaux de synthèse bibliographique sont fournis. Les techniques abordées c’est le test Comet. Les cellules isolées sont incluses dans de l'agarose et déposées sur lame de microscope préalablement recouverte d'un gel d'agarose. L'étape suivante constitue la lyse des organites cellulaires et des membranes cellulaire et nucléaire. Le déroulement de l'ADN se fait par rupture des liaisons hydrogènes. La migration de l'ADN se fait sous un champ électrique. Les lames sont ensuite neutralisées à pH7, puis déshydratées afin de les conserver jusqu'à leur observation. Après coloration au Bromure d'EThidium (BET), les noyaux fluorescents sont observés au microscope à fluorescence relié à un logiciel permettant de quantifier l'ADN présent dans la queue de la comète par rapport à la quantité présente dans la tête de la comète. Les résultats du test comète peuvent être exprimés de plusieurs manières: la distance de migration de l’ADN, l'intensité de fluorescence de la tête et la queue de la comète ainsi que la distance entre le centre de gravité de chacune d'elle. Parmi les paramètres les plus utilisés, on retrouve le tail DNA qui correspond au pourcentage d'ADN dans la queue de la comète, le Tail Moment, et l'Olive Tail Moment qui correspond au pourcentage d'ADN dans la queue de la comète multiplié par la distance séparant les centres de la queue et de la tête 5- Représentation des résultats et leur signification L'utilisation de la dreissène comme bioindicateur de la contamination du milieu aquatique a été développée par des études réalisées sur des moules encagées sur des sites contaminés ou de référence. Cette méthode de transplantation, utilisant des organismes échantillonnés sur un site de référence puis encagés sur des sites d'étude permet de limiter les biais expérimentaux. En effet, lors du prélèvement, les organismes sélectionnés sont de la même taille, donc du même âge, et sont issus d'une même population. Il s'agit donc d'un groupe d'individus homogène pouvant à priori réagir de façon similaire lors de la transplantation, fournissant une réponse génotoxique plus fiable. Les tests comète et MN ont été utilisés en parallèle sur des hémocytes de moules zébrées. Les résultats montrent un taux de dommages corrélé aux niveaux de pollution des sites d'étude. Cependant aucune étude n'a été menée pour déterminer si la transplantation pouvait avoir un impact sur les dreissènes que ce soit sur leur état physiologique ou sur la réponse génotoxique. En effet, la technique d'échantillonnage et la mise en cage sur un site contaminé sont autant de paramètres pouvant perturber les organismes et modifier le lien potentiel entre la contamination chimique du milieu et les effets biologiques. 6- Application des biomarqueurs de génotoxicité chez la dreissène La recherche d’indicateurs biologiques de la qualité des écosystèmes aquatiques a conduit les chercheurs, depuis les années 1980, à définir les espèces répondant au mieux aux critères d'organismes sentinelles. Les bivalves filtreurs (comme la moule marine Mytilus edulis) sont largement utilisés en biomonitoring marin et leur utilisation s'avère relativement concluante. La moule d'eau douce est un organisme modèle très proche de la moule marine. En effet, son cycle de développement l'apparente davantage aux mollusques bivalves marins déjà bien connus (par leur comportement, leur taille et leur morphologie), avec une phase larvaire libre et une phase adulte fixée comme Mytilus edulis. La moule zébrée est un organisme filtreur caractérisé par un fort taux de filtration, évalué à 1L/jour par moule. La moule zébrée accumule donc les contaminants directement de la colonne d'eau et du matériel particulaire. La dreissène résiste relativement bien aux perturbations du milieu et a une longue durée de vie (4 à 7 ans). La sensibilité aux agents génotoxiques a été montrée à plusieurs reprises chez la dreissène ont détecté une induction de micronoyaux et de cassures à l'ADN par le pentachlorophénol. Ont démontré la capacité de la dreissène à métaboliser le BaP par la mise en évidence d’adduits à l'ADN. L'étude de l'induction des dommages à l'ADN par des expositions à des génotoxiques a été réalisée avec du triclosan, du BaP, ou du cadmium. Ces études décrivent les effets induits par une exposition d'organismes à des contaminants mais aucune n'a étudié l'évolution du taux de cassures à l'ADN lors d’une phase de dépuration des organismes et de ce fait ne permettent pas d'estimer la stabilité dans le temps des lésions induites à l'ADN. Afin d'optimiser l'utilisation de cette espèce comme bioindicateur, plusieurs outils d'évaluation de la réponse génotoxique des organismes face à la contamination du milieu ont été utilisés. Parmi ces tests, on retrouve le test comète, le test des micronoyaux et la détection des adduits. Mersch relevait les avantages à utiliser la dreissène comme bioindicateur in en notant que l'induction de micronoyaux (MN) dans les hémocytes était proportionnelle à la contamination du milieu. En 2000, les premiers résultats du test comète réalisé in vitro et in situ sur des hémocytes de moules zébrées confirment l'intérêt de ce test notamment dans l'évaluation la génotoxicité en eau douce. Les lésions détectées par ce test sont les cassures de brins d'ADN ainsi que les sites alcali-labiles induits par l'action de composés génotoxiques (directs ou indirects). Dans la seconde moitié des années 1990 les recherches visant à évaluer l'utilisation de la dreissène comme bioindicateur de la qualité des eaux douces se sont multipliées. Plusieurs types cellulaires de dreissènes tels que les cellules de la glande digestive, de l'hémolymphe ou des branchies ont été utilisés pour la mesure de biomarqueurs de génotoxicité. Le taux d’induction de micronoyaux par exposition à des génotoxiques de référence s'est révélé plus élevé dans les cellules branchiales que dans les cellules hémocytaires. En effet, par rapport aux autres types de cellulaires, les branchies sont en contact continu avec les contaminants dissous. Une partie des cassures de brins mesurée par le test comète résulte des uploads/Marketing/ mstgl-rapport-ecotoxicologie-marin-nom-abderrahim-aarab-amp-younes-oubaki.pdf