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Reconstitution de communaut´ es microbiennes complexes pour l’inhibition de Lis

Reconstitution de communaut´ es microbiennes complexes pour l’inhibition de Listeria monocytogenes ` a la surface de fromages ` a pˆ ate press´ ee non cuite Emilie Retureau To cite this version: Emilie Retureau. Reconstitution de communaut´ es microbiennes complexes pour l’inhibition de Listeria monocytogenes ` a la surface de fromages ` a pˆ ate press´ ee non cuite. Food and Nutrition. Universit´ e Blaise Pascal - Clermont-Ferrand II; Universit´ e d’Auvergne - Clermont-Ferrand I, 2010. French. <NNT : 2010CLF22035>. <tel-00719220> HAL Id: tel-00719220 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00719220 Submitted on 19 Jul 2012 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entiﬁc research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destin´ ee au d´ epˆ ot et ` a la diﬀusion de documents scientiﬁques de niveau recherche, publi´ es ou non, ´ emanant des ´ etablissements d’enseignement et de recherche fran¸ cais ou ´ etrangers, des laboratoires publics ou priv´ es. 1 UNIVERSITE BLAISE PASCAL UNIVERSITE D’AUVERGNE N° D.U. 2035 Année 2010 ECOLE DOCTORALE SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE N° d’ordre 518 Thèse Présentée à l’Université Blaise Pascal Pour l’obtention du grade de DOCTEUR D’UNIVERSITE (Spécialité : Nutrition et Sciences des Aliments) Soutenue le 8 juin 2010 Emilie RETUREAU ___________________________________________________________________________ Reconstitution de communautés microbiennes complexes pour l’inhibition de Listeria monocytogenes à la surface de fromages à pâte pressée non cuite ___________________________________________________________________________ Président : M. G. FONTY, Directeur de Recherches, Université Blaise Pascal de Clermont- Ferrand Rapporteurs : Mme N. DESMASURES, HDR, Maître de Conférence, Université de Caen Basse Normandie Mr E. BEUVIER, HDR, Ingénieur de Recherche, INRA, Poligny Membre : Mme M. C. MONTEL, Directeur de Recherches, INRA, Aurillac, Directeur de thèse Invité : Mr P. VEISSEIRE, Maître de Conférence, IUT, Aurillac Unité de Recherches fromagères – Institut National de la Recherche Agronomique - Aurillac 2 3 Remerciements Je tiens tout d’abord à remercier Mme Marie-Christine Montel, directeur de l’Unité de Recherches Fromagères de l’INRA d’Aurillac et directeur de thèse pour m’avoir accueilli au sein de l’unité et pour m’avoir aidé à mener à bien cette étude. Merci à Mr Gérard Fonty, directeur de Recherches à l’Université Blaise Pascal, qui m’a fait l’honneur d’accepter d’être président de mon jury de thèse. Merci à Mme Nathalie Desmasures, Maître de conférence à l’Université de Caen Basse Normandie et Mr Eric Beuvier, directeur de Recherches à l’INRA de Poligny, d’avoir accepté de juger ce travail et d’en être les rapporteurs. Je tiens également à remercier Mr Philippe Veisseire, Maître de conférence à l’IUT de Biotechnologies d’Aurillac, d’avoir accepté de participer au jury de cette thèse. J’ai en plus eu la chance de travailler avec toi sur l’HPLC à l’URF et à l’IUT et même si on a un peu « galéré », je crois qu’on s’en est pas mal sorti au final ! Bon courage pour la suite des caractérisations de souches et encore merci pour ton aide et tes mots justes. Merci au programme TRUEFOOD “Traditional United Europe Food” Integrated Project financed by the European Commission under the 6th Framework Programme for RTD (Contract n. FOOD-CT-2006-016264) - qui a financé cette thèse et à tous les membres du WP2 dont les travaux m’auront enrichi. Je remercie aussi chaleureusement toute l’équipe de l’unité Génie et microbiologie des procédés alimentaire de l’INRA à Thiverval-Grignon pour leur accueil d’une semaine et en particulier Armelle Delile qui m’a consacré du temps pour me former aux dosages HPLC. Je remercie l’ensemble du personnel de l’URF pour leur amitié, leur aide et leur soutien dans les bons et les mauvais moments, durant ces années passées à Aurillac. J’aurai pu profiter avec vous d’un cadre idyllique de travail dans des locaux neufs ! Merci à tous pour votre contribution morale ou technique à ces travaux : - René Lavigne pour les fabrications fromagères - Robert Didienne pour les fabrications fromagères et la caractérisation des souches avec Philippe. - Béatrice Desserre pour son amitié et son aide précieuse pour les analyses microbiologiques. - Cécile Callon pour l’identification des levures et surtout pour avoir accepté de partager ton bureau avec moi. Je crois que moi comme toi, nous nous souviendrons longtemps de TRUEFOOD…Je garderai en mémoire ton empathie du stress qui m’aura en quelque sorte permis de me libérer en partie du mien (Cqfd Rennes !) et nos échanges sur les petites galères de manip… Je pense bien à toi pour la suite… - Céline Delbès pour m’avoir formé à la SSCP et pour ses bons conseils. - Françoise Monsallier et Isabelle Verdier pour leur soutien et leurs bons conseils. Un clin d’œil particulier à Michèle Gauzins, toujours disponible pour régler les petits problèmes administratifs, les commandes pressées… Merci surtout pour ton amitié sincère et ton soutien durant ces années. Merci au Pôle fromager, Sophie Hulin, Christelle…. Et Caroline Châtelard, j’aurais fait un peu parti de votre petite famille… 4 5 Je n’oublie pas non plus de remercier ma famille : papa, maman, Julie, Luis pour leur soutien à toute épreuve, même à 536 km ! Me voilà de retour maintenant ! Une pensée pour Caco, merci pour ton amitié indéfectible et vive le téléphone illimité ! Je n’oublie pas de remercier aussi tous mes amis « stagiaires » ou non, qui sont passés, restés ou repartis…Lucie, Elise, Pierre et Robin, l’année 2007 est gravée dans ma mémoire et tous les bons moments qu’on a passé ensemble ! Fanny, Caro, Delphine, un grand merci pour votre soutien, je crois que l’on ne se perdra pas de vue ! Et vive nos soirées gastronomiques et autres soirées fromages, et tous les bons moments passés ensemble ! Je vous souhaite bonne continuation et on se reverra, c’est sûr ! Enfin, bonne continuation à tous et vive le fromage au lait cru ! 6 7 Sommaire Liste des abréviations------------------------------------------------------------------------------ 13 Introduction----------------------------------------------------------------------------------------- 15 Etude Bibliographique----------------------------------------------------------------------------- 21 1. Listeria monocytogenes--------------------------------------------------------------------- 21 1.1. Généralités sur Listeria monocytogenes------------------------------------------------ 21 1.2. Pouvoir pathogène------------------------------------------------------------------------ 21 1.2.1. Listériose---------------------------------------------------------------------------- 21 1.2.2. Virulence de Listeria monocytogenes------------------------------------------- 23 1.3. L. monocytogenes dans les produits laitiers -------------------------------------------- 27 1.3.1. Réglementation--------------------------------------------------------------------- 27 1.3.2. Contamination des laits------------------------------------------------------------ 27 1.3.3. L. monocytogenes dans les fromages -------------------------------------------- 29 2. Les technologies de barrières---------------------------------------------------------------- 35 2.1. Facteurs physiques------------------------------------------------------------------------- 37 2.1.1. Température------------------------------------------------------------------------ 37 2.1.2. Traitements par les hautes pressions-------------------------------------------- 41 2.1.3. Champs pulsés---------------------------------------------------------------------- 41 2.1.4. Irradiations-------------------------------------------------------------------------- 43 2.2. Facteurs physico-chimiques-------------------------------------------------------------- 43 2.2.1. Teneur en NaCl--------------------------------------------------------------------- 43 2.2.2. L’activité de l’eau (aw)------------------------------------------------------------ 45 2.2.3. Le système lactoperoxydase------------------------------------------------------ 45 2.3. Facteurs liés à la vie microbienne------------------------------------------------------- 47 2.3.1. Méthodes culture dépendante des microorganismes------------------------ 49 2.3.2. Méthodes moléculaires indépendantes de la culture -------------------------- 49 2.3.3. Les communautés microbiennes des fromages et propriétés anti-listeria associées------------------------------------------------------------------------------- 61 Matériels et Méthodes-----------------------------------------------------------------------------109 1. Fabrication des fromages au lait pasteurisé-------------------------------------------109 2. Préparation des consortiums inoculés à la surface des fromages-----------------111 2.1. Préparation des consortiums complexes issus de croûtes de fromages fermiers St Nectaire -------------------------------------------------------------------------------111 2.1.1. Préparation des 34 consortiums complexes issus de croûtes de fromages fermiers St Nectaire---------------------------------------------------------------111 2.1.2. Préparation de consortiums complexes issus de la propagation du consortium complexe TR15--------------------------------------------------------------------111 2.1.3. Préparation de consortiums à partir des culots et surnageants issus du consortium complexe TR15------------------------------------------------------113 2.2. Préparation de communautés microbiennes reconstituées----------------------113 2.2.1. Constitution de collections d’isolats issus du consortium complexe TR15-------- ---------------------------------------------------------------------------------------113 2.2.2. Identification des isolats-----------------------------------------------------------113 8 9 2.2.3. Clonage et séquençage du consortium complexe TR15---------------------- 115 2.2.4. Propriétés anti-listeria des souches in vitro------------------------------------ 117 2.2.5. Préparation et conservation des souches pour la constitution de consortiums---- --------------------------------------------------------------------------------------- 117 2.2.6. Reconstitution de consortiums à partir des souches de la collection-------- 119 2.2.7. Préparation de consortiums à partir des pools d’isolats cultivables issus du consortium complexe TR15------------------------------------------------------ 121 3. Inoculation des surfaces des fromages fabriqués à partir de lait pasteurisé---- 121 3.1. Inoculation de L. monocytogenes-------------------------------------------------- 121 3.2. Inoculation des croûtes des fromages avec les différents consortiums------- 123 3.2.1. Inoculations des consortiums complexes--------------------------------------- 123 3.2.2. Inoculations des consortiums reconstitués------------------------------------- 123 3.3. Affinage et prélèvements----------------------------------------------------------- 125 4. Analyses microbiologiques------------------------------------------------------------------ 125 4.1. Dénombrements des flores microbiennes sur les milieux de cultures-------- 125 4.2. Analyse des isolats bactériens des milieux de dénombrements CRBM et BHI----- ----------------------------------------------------------------------------------------- 127 4.3. Analyse par Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)------------ 127 4.3.1. Préparation des acides nucléiques----------------------------------------------- 127 4.3.2. Réaction de Polymérisation en Chaine (PCR)--------------------------------- 129 4.3.3. Electrophorèse sur gel d’agarose------------------------------------------------ 129 4.3.4. Electrophorèse capillaire--------------------------------------------------------- 131 4.3.5. Analyse des profils SSCP--------------------------------------------------------- 131 5. Analyses physico-chimiques et biochimiques-------------------------------------------- 131 5.1. Mesures de pH------------------------------------------------------------------------131 5.2. Mesures des extraits secs----------------------------------------------------------- 131 5.3. Dosages des sucres et acides organiques des croûtes de fromages par méthode enzymatique-------------------------------------------------------------------------- 133 5.4. Dosages des sucres et acides organiques par chromatographie liquide haute pression (HPLC)--------------------------------------------------------------------- 133 5.4.1. Préparation des croûtes de fromages pour analyses HPLC------------------- 133 5.4.2. Analyse HPLC---------------------------------------------------------------------- 133 6. Caractérisation des potentialités des souches issues de l’identification du consortium complexe TR15 à produire des acides organiques in vitro---------------------------- 135 6.1. Préparation du milieu fromager---------------------------------------------------- 135 6.2. Préparation des géloses milieu fromager ensemencées avec les souches du consortium complexe TR15 pour analyse HPLC------------------------------- 137 7. Analyses uploads/Science et Technologie/ document-cercetare-fermenti 1 .pdf