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AVERTISSEMENT Ce document est le fruit d'un long travail approuvé par le jury de soutenance et mis à disposition de l'ensemble de la communauté universitaire élargie. Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de référencement lors de l’utilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pénale. Contact : ddoc-memoires-contact@univ-lorraine.fr LIENS Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10 http://www.cfcopies.com/V2/leg/leg_droi.php http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm Université de lorraine Faculté des sciences et techniques Master microbiologie spécialité biotechnologies microbiennes Validation de méthodes de Validation de méthodes de quantification du microbiote quantification du microbiote intestinal humain : effet de l’inuline intestinal humain : effet de l’inuline sur la microflore d’un intestin sur la microflore d’un intestin artificiel artificiel Par Charlotte Baptiste 14 février 2013 - 14 août 2013 Laboratoire PERITOX-INERIS, Périnatalité et risques toxiques EA 4285 – UMI 01 Unité mixte INERIS . UFR de médecine ,Université de Picardie Jules vernes , Amiens Encadrants Dr. Hafida KHORSI-CAUET Dr. Pascale GADONNA-WIDEHEM Unité de recherche EGEAL (Expression de Gènes et régulation Epigénétique par l’Aliment)- UPSP 2007.05.137. Institut Polytechnique LaSalle Beauvais J e tiens à remercier le Dr Véronique Bach et le Dr Latifa Abdennebi-Najar de m’avoir ouvert leurs portes et laisser la possibilité d’effectuer mon stage de recherche au sein des laboratoires PERITOX et EGEAL. Je remercie tout particulièrement le Dr Hafida KHORSI-CAUET et le Dr Pascale GADONNA- WIDEHEM de m’avoir formé avec patience sur les différentes techniques de laboratoire, de m’avoir montré leur façon de travailler et ainsi de m’avoir guidé tous le long de ma formation. J’ai été très heureuse de travailler avec mes 2 responsables qui ont toujours été présentes pour moi et qui m’ont soutenu malgré les problèmes rencontrés lors des expériences. Travailler en synergie entre 2 laboratoires m’a permis de découvrir 2 façons de travailler qui m’ont été complémentaires et qui m’ont permis d’avancer et progresser dans l’autonomie au travail. Mais surtout, j’ai pu découvrir 2 équipes de recherches sympathiques et travailleuses avec qui j’ai effectué mon stage dans la bonne humeur et dans l’efficacité. C’est grâce également à Véronique et David que j’ai pu trouver rapidement mes marques dans le laboratoire de Microbiologie et je leur remercie d’avoir été là pour moi, pour m’avoir montré les règles et protocoles de travail au sein du laboratoire. Je remercie les doctorants avec qui j’ai pu travailler. Merci à Julie qui m’a accueillie les premiers jours de stage et qui m’a tout de suite intégrée au sein du laboratoire, grâce à elle j’ai beaucoup appris et elle m’a surtout énormément aidée. Merci à Cynthia aussi d’avoir pris le temps de m’expliquer avec patience les protocoles et de m’avoir transmis sa rigueur et sa précision au travail et merci aussi à Samir d’avoir toujours pu répondre à mes questions et m’avoir montré quelques techniques pour améliorer mon travail. Enfin merci aux autres stagiaires avec qui j’ai pu travailler, je pense notamment à Anaïs et Lucie qui m’ont aidé lors d’expériences contraignantes et que j’ai pu aider à mon tour . Merci à tous, non seulement pour la richesse de travail que cela m’a apporté mais également pour l’ambiance et la bonne entente qui régnaient. Grace à ce stage, et à toute l’équipe mon envie de continuer dans le monde de la recherche s’est confirmée. Remerciements Merci Liste des abréviations I. Introduction ................................................................................................................ 1 A. Contexte ..................................................................................................................................... 1 B. Présentation des laboratoires .................................................................................................... 2 C. Généralités ................................................................................................................................. 3 1. Tractus digestif : composition et fonctions ............................................................................. 3 2. Microbiote intestinal .............................................................................................................. 4 a) Variation du microbiote au cours du temps ....................................................................... 4 b) Grandes fonctions du microbiote intestinal ....................................................................... 7 c) Exemples de Maladies liées au microbiote intestinal ......................................................... 8 3. Prébiotiques ........................................................................................................................... 8 a) Définition ............................................................................................................................ 8 b) Inuline ................................................................................................................................. 9 II. Matériel et méthodes ................................................................................................ 11 A. Etude in vitro: SHIME( Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystem) ........................... 11 1. Principe ................................................................................................................................. 11 2. Solutions nécessaires au fonctionnement du système ......................................................... 11 3. Mise en route du système .................................................................................................... 12 4. Suivi quotidien ...................................................................................................................... 12 5. Démarche expérimentale ..................................................................................................... 13 6. Préparation des échantillons ................................................................................................ 13 B. Etude in Vivo (fèces humaines) ................................................................................................ 13 C. Analyse du microbiote intestinal .............................................................................................. 14 1. Méthode de la microbiologie classique ................................................................................ 14 2. Méthode de la Cytométrie de flux ........................................................................................ 14 3. Méthode de la qPCR ............................................................................................................. 16 D. Mise au point d’un protocole d’hybridation d’une sonde sur cellules bactériennes ................ 17 III. Résultats ................................................................................................................... 18 A. Validation des méthodes d’analyses de la flore fécale ............................................................. 18 1. Comparaison de dénombrement par microbiologie classique et par qPCR ......................... 18 2. Dénombrement par cytométrie de flux ................................................................................ 19 B. Etude in vivo ............................................................................................................................. 20 Sommaire 1. Variation de la flore fécale en fonction de l’âge ................................................................... 21 2. Variation de la flore fécale en fonction de la congélation .................................................... 22 3. Influence d’un traitement prébiotique (inuline) sur la flore fécale ...................................... 23 4. Variation inter-individus de la flore fécale............................................................................ 24 5. Analyses cytométriques ........................................................................................................ 25 C. Etude in vitro / SHIME .............................................................................................................. 25 1. Analyse de la flore totale ...................................................................................................... 25 2. Analyses des différents profils bactériens ............................................................................ 26 3. Variation du pH..................................................................................................................... 27 D. Mise au point d’un protocole d’hybridation ............................................................................. 28 IV. Discussion / Perspectives .......................................................................................... 29 A. Mises au point des méthodes ................................................................................................... 29 B. Étude in vivo ............................................................................................................................. 30 C. Etude in vitro ............................................................................................................................ 31 V. Conclusion ................................................................................................................. 33 VI. Références bibliographiques ..................................................................................... 35 VII. Annexes .................................................................................................................... 40 VIII. Figures ...................................................................................................................... 49 ADN Acide DésoxyriboNucléique AGCC Acide Gras à Courte Chaîne ANOVA ANalysis Of VAriance BCP BromoCresol Purple BD Baird Parker BEA gélose à la Bile, à l’Esculine et à l’Azide de sodium CPF Chlorpyrifos CY Cyanine DFG Débit de Filtration Glomérulaire EDTA Acide Ethylène Diamine Tétraacétique EGEAL Expression de Gêne et régulation Epigénétique par l’Aliment FITC Fluorescein Isothiocyanate FOS Fructo-oligosaccharides FSC Forward Scatter GOS Galacto-oligosaccharides INERIS Institut National de l’Environnement Industriel et des Risques IP Iodure de Propidium LOG Logarithme M Molaire MICI Maladie Inflammatoire Chronique de l’Intestin MRS Man, Rogosa et Sharpe MSA Mannitol Salt Agar NBR Nombres PBS Phosphate Buffered Saline PCA Plate Count Agar PCR Polymerase Chain Reaction PERITOX Périnatalité et Risques toxiques pH Potentiel Hydrogène PLSD Procédure de « least significant difference method » POTENTIEL REDOX Potentiel d’oxydoréduction PPM Partie par million QPCR PCR en temps réel R2 Coefficient de détermination SDS dodécylsulfate de sodium SFP Shahidi-Ferguson Perfringens SHIME Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystem SPS Sulfite de Sodium –Polymixine SSC Side Scatter TOS Transgalacto-oligosaccharides TRIS Trishydroxyméthylaminométhane UFC Unité formant une colonie UPJV Université de Picardie Jules Vernes VITROSIM Simulation in vitro VRBG Gélose au cristal violet, rouge neutre, bile et glucose XOS Xylo-oligosaccharides Liste des abréviations 1 I. Introduction A. Contexte Depuis quelques années, les questions environnementales ont pris une place importante dans la société. Ceci est dû notamment à la prise de conscience du réchauffement climatique et de l’impact de l’action humaine sur l’écologie. Notre environnement et notre santé sont menacés par différents éléments comme le rejet des gaz à effet de serre (Petit, 2001) , (Tubiana, 2000) ou encore la pollution par les produits radioactifs (Baysson et Tirmarche, 2008). Parmi ces éléments, nous retrouvons les pesticides qui sont utilisés de façon importante dans l’agriculture et qui entrainent une contamination de notre alimentation notamment des fruits et légumes (Wang et al., 2013). Le risque lié à l’exposition aux pesticides est devenue un sujet de préoccupation, d’autant que la France est le troisième consommateur mondial et premier utilisateur en Europe de pesticides avec 62 700 tonnes de pesticides consommées en 2011 (selon l’union des industries de la protection des plantes). Les preuves de la nocivité des pesticides pour la santé humaine commencent à s’accumuler : les données récentes indiquent que les pesticides peuvent endommager le système immunitaire (Weselak et al., 2007), et seraient capable d’imiter les hormones causant divers troubles de santé. Ainsi les études démontrent une incidence accrue des cancers du sein, de la prostate, du côlon, des testicules, de l'estomac (Mostafalou et Abdollahi, 2013)(Alavanja et Bonner, 2012). De plus, les pesticides auraient une incidence sur certaines maladies neurologiques (Dutheil et al., 2010) comme Alzheimer, ou Parkinson et seraient responsables de certains troubles du comportement liées aux suicides et dépressions (Freire et Koifman, 2013). D’autres troubles de santé sont associés comme le diabète, les maladies cardiovasculaires, les problèmes respiratoires (Weselak et al., 2007),(Gilden et al., 2010). C’est pour cela que la France s’est engagée dans un processus de réduction de l’emploi des pesticides dans l’agriculture via un plan interministériel en 2006 (Plan ECOPHYTO 2018 visant une diminution de 50% des pesticides d’ici 2018) et le grenelle de l’environnement a confirmé cette orientation (Butault et al., 2011). Dans cette optique, le projet PREBIODIG « Effets bénéfiques des PREBIOtiques suite à l’ingestion d’un pesticide, le chlorpyriphos, sur le développement et la maturation du système DIGestif » a été proposé dans le but de réduire les effets d’un pesticide, le Chlorpyrifos (CPF), très utilisé en Picardie. uploads/Science et Technologie/ methode-de-denombrement-de-la-flore-intestinale-these.pdf