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HAL Id: tel-03506233 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-03506233 Submitted on 2 Jan 2022 HAL is a multi-disciplinary open access archive for the deposit and dissemination of sci- entific research documents, whether they are pub- lished or not. The documents may come from teaching and research institutions in France or abroad, or from public or private research centers. L’archive ouverte pluridisciplinaire HAL, est destinée au dépôt et à la diffusion de documents scientifiques de niveau recherche, publiés ou non, émanant des établissements d’enseignement et de recherche français ou étrangers, des laboratoires publics ou privés. Analyse de la résistance aux antibiotiques chez les entérobactéries et étude d’une potentielle voie alternative aux traitements antibiotiques Amel Mhaya To cite this version: Amel Mhaya. Analyse de la résistance aux antibiotiques chez les entérobactéries et étude d’une potentielle voie alternative aux traitements antibiotiques. Médecine humaine et pathologie. Université de Bordeaux; Université de Sfax (Tunisie), 2019. Français. NNT : 2019BORD0420. tel-03506233 1 THÈSE EN COTUTELLE PRÉSENTÉE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE BORDEAUX, FRANCE ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE SPÉCIALITÉ : MICROBIOLOGIE - IMMUNOLOGIE ET DE LA FACULT É DES SCIENCES DE SFAX, TUNISIE ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES FONDAMENTALES SPÉCIALITÉ : SCIENCES BIOLOGIQUES Par Amel MHAYA Analyse de la résistance aux antibiotiques chez les entérobactéries et étude d’une potentielle voie alternative aux traitements antibiotiques Sous les directions du Pr. Corinne ARPIN et du Pr. Slim TOUNSI Soutenue le 13 Décembre 2019 Membres du jury: Pr. Véronique DUBOIS PU-PH, Université de Bordeaux Président Pr. Raphaël DUVAL PU, Université de Lorraine, Nancy Rapporteur Pr. Mamdouh BEN ALI PU, Centre de Biotechnologie, Sfax Rapporteur Pr. Sami MAALEJ PU, Université de Sfax Examinateur République Tunisienne Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique ************* 2 REMERCIEMENTS A mon jury de thèse, Madame la Professeure Corinne ARPIN ma directrice de thèse en France, pour m’avoir accueillie dans votre unité de recherche et m’avoir dirigé, encadré et guidé dans ce travail et surtout pour m’avoir donné la chance de continuer mes recherches dans votre laboratoire. Merci pour vos conseils, et pour m’avoir enseigné la rigueur scientifique, la démarche scientifique et le sens critique. Monsieur le Professeur Slim TOUNSI, mon directeur de thèse en Tunisie, pour m’avoir accueillie dans votre unité de recherche, merci pour la confiance, l’encouragement et également pour votre disponibilité et patience. Monsieur Mamdouh BEN ALI et Monsieur Raphaël DUVAL pour avoir accepté d’être rapporteurs de ce manuscrit de thèse, Mme Véronique Dubois pour avoir accepté d’examiner ce travail et être présidente du jury de thèse. Je remercie également Monsieur Sami MAALEJ pour avoir accepté d’examiner ce travail. A L’UMR 5234, Je tiens à remercier tout particulièrement le Docteur Dominique Bégu pour les idées techniques et scientifiques partagées et la contribution dans tous les projets surtout dans la production de la bacthuricine recombinante, ainsi que toutes les constructions du gène mgrB. 3 J'adresse mes remerciements à Marie-Line Andreola et toute l’équipe virologie-bactériologie et tous les membres de l’Unité UMR5234, merci pour tous les services techniques, les discussions scientifiques ou non scientifiques. Au centre de biotechnologie de Sfax (laboratoire de biopesticide), Je tiens à remercier tout particulièrement toute l’équipe de biopesticide pour tous les services, les conseils techniques et les discussions scientifiques. A ma chère famille, Mon père, ma mère, mon frère, mes 3 sœurs, mes beaux frères et ma belle sœur qui m'ont soutenue au cours de mes études en France. Merci pour votre soutien et vos encouragements. A mes ami(e)s, Merci pour votre soutien et présence, et pour tous les momemts partagés ensemble. 4 ABREVIATIONS BLSE Bêta-Lactamase à Spectre Etendu CASFM Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie DO Densité optique EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Kb Kilobases LB Luria-Bertani MH Mueller-Hinton McF Mac Farland CS Colistine LPS Lipopolysaccharide LAra4N 4-amino-4-deoxy-L-arabinose CMI Concentration Minimale Inhibitrice CPS Capsule polysaccharidique MLST Multi Locus Sequence Typing Pb Paire de bases PCR Polymerase Chain Reaction PEtN Phosphoéthanolamine PFGE Pulsed-Field Gel Electrophoresis R Résistant S Sensible ST Séquence-type UFC Unité formant colonies HR Hétérorésistance Bt Bacillus thuringiensis PAP Population analysis profile BLAST Basic Local Alignment Search Tool 5 Tableaux Tableau 1 : Répartition des clusters et des espèces du complexe Enterobacter cloacae en utilisant la technique de séquençage de gène hsp 6012 ............................................................ 23 Tableau 2. Résistances naturelles aux ß-lactamines chez l’ordre des Enterobacterales ......... 25 Tableau 3. Les principales β-lactamines .................................................................................. 32 Tableau 4. Conditions des cycles d’amplification par PCR ..................................................... 54 Tableau 5. Amorces des jonctions de plasmide IncHI2 ........................................................... 59 Tableau 6. Répartition des 170 entérobactéries identifiées lors d’infections urinaires en fonction de leur site de prélèvements et de la présence de BLSE ............................................ 71 Tableau 7. Caractéristiques des 15 E. coli productrices de BLSE analysées dans cette étude ................................................................................................................................................. .74 Tableau 8. Caractéristiques des 8 K. pneumoniae productrice de BLSE analysées dans cette étude ......................................................................................................................................... 75 Tableau 9. Liste des amorces utilisées pour tester la résistance à la colistine ....................... 105 Tableau 10. Tampons pour préparer les cellules chimiocompétentes .................................... 107 Tableau 11. Amorces utilisées pour les étapes de sous-clonage et de clonage chez Eh22 et K. pneumoniae ............................................................................................................................ 108 Tableau 12. Valeurs de CMI de colistine de souches et de transformants d'E. hormaechei et K. pneumoniae contenant différentes constructions du gène mgrB. ........................................... 111 Tableau 13. Fréquences de mutation chez 7 souches d’ECC appartenant à des clusters ‘’cliniques’’ ............................................................................................................................ 114 Tableau 14. Profil des souches de clusters cliniques du complexe d’E. cloacae ................... 116 Tableau 15. Classification des bactériocines selon Cotter et al 180 ........................................ 122 Tableau 16. Classification des bactériocines produites par B. thuringiensis selon Salazar- Marroquín et al. 294 ................................................................................................................. 141 Tableau 17. Amorces utilisées pour amplifier le gène de la bacthuricine Bt 103 .................. 148 6 Figures Figure 1. Mécanismes intrinsèques de résistance de la résistance aux ß-lactamines par défaut d’accumulation. ........................................................................................................................ 25 Figure 2. Résumé des principaux mécanismes de mobilisation des gènes de résistance chez les entérobactéries17. ...................................................................................................................... 27 Figure 3. Principales caractéristiques structurelles des plasmides IncN, IncF et IncA/C. ....... 28 Figure 4. Les principales porines non sélectives de la membrane externe d’E. coli . .............. 30 Figure 5. Schéma de l’assemblage et mécanisme de fonctionnement de la pompe AcrAB– TolC24. ...................................................................................................................................... 31 Figure 6. Mécanisme d’action des bêta-lactamines28 ............................................................... 33 Figure 7. Mécanisme de résistance aux bêta-lactamines27 ....................................................... 33 Figure 8. Relation moleculaire et fonctionnelle entre les β-lactamases31 ................................ 35 Figure 9. Des positions mutées dans la séquence de β-lactamases de type TEM et le nombre d'enzymes substituées à ces positions. ..................................................................................... 39 Figure 10. Diversité des BLSE chez les Enterobacteriaceae isolés à partir d'échantillons cliniques dans 18 hôpitaux français (n = 200) 39 ...................................................................... 40 Figure 11. Les six sous-lignées (ou groupes) connues de β-lactamases de type CTX-M, présentées dans un diagramme en arborescence qui reflète la similarité au niveau de la séquence des acides aminés49. .................................................................................................. 41 Figure 12. Distribution mondiale des types CTX-M59 ............................................................ 42 Figure 13. Carte de l’Europe montrant les données 2018 sur les fréquences d’E. coli (A) et de K. pneumoniae (B) résistants aux C3G. ................................................................................... 43 Figure 14. Répartition des différents types de carbapénémases parmi les Entérobactéries productrices de carbapénémases dans le monde68 .................................................................... 45 Figure 15. Distribution mondiale de carbapénémases KPC chez K. pneumoniae 34................ 46 Figure 16. Distribution mondiale de carbapénémases de métallo-β-lactamases de New Delhi chez les entérobactéries et P. aeruginosa34 ............................................................................. 47 Figure 17. Analyse phylogénétique des variants de métallo-β-lactamase-1 (NDM-1). ........... 48 Figure 18. Distribution mondiale de carbapénémases type oxacillinase OXA-48 chez les entérobactéries et P. aeruginosa34. ........................................................................................... 49 Figure 19. Carte géographique de la Tunisie avec les différentes régions où les échantillonnages ont été réalisés .............................................................................................. 50 Figure 20. Electrophorèse sur gel d'agarose des amplicons PCR du clade ST13163 ................ 57 Figure 21. Analyse des pulsotypes (enzyme Spe1) des souches Eh22 et Eh23 ....................... 61 7 Figure 22. Antibiogramme de la souche Eh22 (méthode de diffusion sur milieu MH). .......... 61 Figure 23. Antibiogramme de la souche Eh22 réalisé sur une gélose MH contenant 250 mg/l de cloxacilline .......................................................................................................................... 62 Figure 24. PFGE-S1 nucléase de Eh22 et du Tc 22(C600) ...................................................... 64 Figure 25. Résultats de l’électrophorèse sur gel d'agarose des amplicons obtenus après amplification des gènes des β-lactamases ................................................................................ 65 Figure 26. Analyse du plasmide pTc300 comparé à un plasmide de 444 kpb, p-444 (CP028197) isolé de Salmonella spp (VistaTools for Comparative Genomics). ..................... 67 Figure 27. Antibiogramme de la souche de K. pneumoniae 18TA .......................................... 76 Figure 28. Pulsotype (XbaI) des souches d’15 E. coli productrices de BLSE ........................ 76 Figure 29. Antibiogramme du transconjugant Tc18TA (E. coli C600) .................................. 78 Figure 30. Structure de la colistine et polymyxine B122 ........................................................... 85 Figure 31. Schéma illustrant le mode d’action présumé des polymyxines au niveau des membranes interne et externe des bactéries à Gram négatif. ................................................... 86 Figure 32. Voies de régulation des modifications du LPS chez K. pneumoniae122 ................. 88 Figure 33. Alignement de différents MgrB identifiés à partir de séquences génomiques de bactéries de l’ordre des Enterobacterales124 ............................................................................ 89 Figure 34. Mutations chromosomiques dans le gène mgrB et les changements uploads/Science et Technologie/ mhaya-amel-2019.pdf