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N° d’ordre (INP) : (USJ) : THESE Présentée pour obtenir le titre de DOCTEUR DE

N° d’ordre (INP) : (USJ) : THESE Présentée pour obtenir le titre de DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE École doctorale Transferts, Dynamique des Fluides, Energétiques et Procédés Spécialité : Génie des procédés et de l’environnement DOCTEUR DE L’UNIVERSITE SAINT JOSEPH DE BEYROUTH École doctorale Sciences et Santé Spécialité : Sciences de la Vie Par André EL KHOURY Champignons Mycotoxinogènes et Ochratoxine A (OTA) et Aflatoxine B1 (AFB1) dans les vignobles libanais : Occurrence et Origine Soutenue le 3 Juillet 2007 devant le jury composé de : M. A. LEBRIHI : Directeur de thèse. Professeur INP-ENSAT. Toulouse M. T. RIZK : Directeur de thèse. Professeur Fac. des Sciences. USJ.Beyrouth M. S. ROUSSOS. Rapporteur. Directeur de Recherche. IRD. Marseille M. R. SALIBA. Rapporteur. Professeur Fac. d’Agronomie. UL. Beyrouth Mme. M-L. DELIA. Membre. Maître de conférences INP-ENSIACET. Toulouse M. R. LTEIF : Membre. Professeur assistant Fac. des Sciences. USJ. Beyrouth Remerciements Ce travail a été réalisé au Laboratoire de Génie Chimique (UMR 5503, CNRSINPT- UPS) au sein du Département « Bioprocédés et Systèmes Microbiens » à l’École Nationale Supérieure Agronomique de Toulouse (ENSAT-INPT) sous la direction scientifique de Monsieur le Professeur Ahmed LEBRIHI et au Centre d’Analyses et de Recherches de la Faculté des Sciences de l’Université Saint-Joseph (FS-USJ) sous la direction scientifique de Monsieur le Professeur Toufic RIZK.. Je tiens à leur exprimer toute ma reconnaissance et mes sincères remerciements pour leur accueil bienveillant au sein des deux laboratoires, pour leurs conseils très précieux et leurs encouragements ainsi que pour la confiance qu'ils m'ont constamment témoignée. A Monsieur Roger LTEIF, Professeur assistant et directeur du Département de chimie de la Faculté des Sciences de l’Université Saint-Joseph, pour votre présence, votre soutien et vos conseils tout au long de ces années, je serai toujours reconnaissant. A Madame Marie-Line Délia, maître de conférence à l’Eensiacet-INP de Toulouse, vous m’avez toujours encouragé, soutenu et guidé. Je vous remercie pour la confiance que vous m’avez témoigné et vous suis reconnaissant de la disponibilité et de l’intérêt. Soyez assurée de mon estime et de ma profonde reconnaissance. J’adresse mes remerciements à Monsieur Sevastianos ROUSSOS, directeur de Recherche à l’Institut de Recherches pour le Développement (IRD-Marseille) d’avoir accepté de participer à ce jury et de juger ce travail en tant que rapporteur. Je lui suis très reconnaissant pour ces judicieuses suggestions. J’adresse mes remerciements à Monsieur Rachad SALIBA, Professeur et Ingénieur de Recherche à la faculté d’agronomie de l’Université Libanaise pour avoir accepté de juger ce travail en tant que rapporteur. Je lui suis très reconnaissant pour toute l’intention particulière qu’il a porté à la correction de cet ouvrage. A mon cher Ami, Docteur Ali ATOUI, pour votre grand cœur et toute l’attention que vous m’avez accordée, Gardez cette bonne humeur qui vous caractérise, quelle chance on a de vous avoir parmi nous. Je tiens également à exprimer ma reconnaissance à Madame Hayat AZOURI TANNOUS Professeur et directeur de laboratoire de Toxicologie à la faculté de Pharmacie de l’Université Saint-Joseph, pour ses conseils, sa collaboration et son aide durant les analyses. J’exprime toute ma reconnaissance et mes sincères remerciements à Madame Yolla GHORRA directrice de la faculté d’Agronomie (ESIAM-ESIA) de l’Université Saint-Jospeh pour son aide précieuse, ses encouragements et son soutien, il serait impossible d’oublier. Je ne saurais oublier Madame Annie LESZKOWICZ Professeur à l’ENSAT de Toulouse et Madame Florence MATHIEU maître de conférence au sein de notre laboratoire, pour leur gentillesse, leurs encouragements et leur sympathie. Mes remerciements vont également à toute l’équipe du Laboratoire de Génie Chimique ENSIACET-ENSAT, j’ai passé des moments agréables avec vous tous. Je vous souhaite à tous une réussite dans tous les domaines, professionnel et personnel mais j’espère que les nombreux kilomètres qui nous séparerons peut-être ne seront jamais un frein à notre amitié et à notre rencontre Liste des abréviations OTA: Ochratoxine A AFB1: Aflatoxine B1 UV: Ultra-Violet Ex: Excitation Em: Emission IR: Infrarouge RMN: Résonnance Magnétique Nucléaire MS : Spectrométrie de Masse IARC (CIRC) : Centre Internationale de Recherche sur le Cancer TCN : Néphropathie Chronique Tunisienne NEB : Néphropathie Endémique du Balkan DL50 : Dose létale qui tue 50% des individus GRAS: Generally Regarded As Safe FDA: Food and Drug Administration CE: Commission Européenne CPDA: Comité Permanent des Denrées Alimentaires JEFCA: Join Expert Committee of Food Additives DRBC: Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar CYA: Czapeck Yeast Extract Agar SGM: Synthetic Grape Medium Temp : Température AW : Activité de l’eau RH: Humidité Relative HPLC: High Performance Liquid Chromatography FLD: Fluorimetric Detection ELISA: Enzyme Linked Immuno sorbent Assay IAC: Immuno Affinity Column PCR: Polymerase Chain Reaction RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism ITS: Internal Trancripted Sequence IGS: Intergenic Spacer Liste de publications et communications PUBLICATIONS EL Khoury, A., Rizk, T., Lteif, R., Azouri, H., Delia, M-L., Lebrihi, A. 2006. Occurrence of ochratoxin A and aflatoxin B1-producing fungi in Lebanese grapes and OTA content in musts and finished wines during year 2004. J.Agri.Food Chem. 54(23), 8977-8982. EL Khoury, A., Rizk, T., Lteif, R., Azouri, H., Delia, M-L., Lebrihi, A. 2007. Fungal contamination and Aflatoxin B1 and Ochratoxin A in Lebanese wine grapes and musts. Soumise in the journal of Food and Chemical Toxicology. POSTER PRESENTATION EL Khoury, A., Rizk, T., Lteif, R., Azouri, H., Delia, M-L., Lebrihi, A. Occurrence de l’Ochratoxine A et de l’Aflatoxine B1 dans les vignobles libanais. VIIIth International Symposium Of Œnologie 2007, Bordeaux, France. Tables des Matières Introduction......................................................................................................... 1 Revue bibliographique .......................................................................................... 5 Propriétés Physico-chimiques de l’Ochratoxine A et de l’Aflatoxine B1................. 6 I-1. L’Ochratoxine A (OTA)............................................................................................7 I-1.1. Définition et structure chimique..........................................................................7 I-1.2 Autres Ochratoxines ...........................................................................................7 I-2. Propriétés physico-chimiques de l’Ochratoxine A ...................................................8 I-3. L’Aflatoxine B1 (AFB1) .........................................................................................10 I-3.1. Définition et structure chimique........................................................................10 I-4. Propriétés physico-chimiques des Aflatoxines ......................................................11 Profil Toxicologique.............................................................................................13 I-5. Ochratoxine A......................................................................................................14 I-5.1.Néphrotoxicité ...................................................................................................14 I-5.2. Génotoxicité......................................................................................................14 I-5.3. Immunotoxicité.................................................................................................16 I-5.4. Tératogénicité ...................................................................................................17 I-5.5. Neurotoxicité ....................................................................................................17 I-5.6. Cancérogenèse..................................................................................................17 I-6. Aflatoxine B1 .......................................................................................................18 I-6.1. Hépatotoxicité...................................................................................................18 I-6.2. Génotoxicité et Mutagénicité .............................................................................18 I-6.3. Immunotoxicité.................................................................................................19 I-6.4.Tératogénicité ....................................................................................................20 Champignons Mycotoxinogènes...........................................................................21 I-7 Principales moisissures mycotoxinogènes.............................................................22 I-7.1 Le genre Aspergillus...........................................................................................22 Aspects macroscopiques du genre Aspergillus ............................................................24 Aspects microscopiques .............................................................................................25 I-7.1.1 Aspergillus et production d’OTA ......................................................................27 a- Aspergillus de la section Nigri.................................................................................27 a.1 Clefs d’identification.............................................................................................28 ● Unisiriés .................................................................................................................28 ● Bisiriés ...................................................................................................................29 ● Les espèces non communes ....................................................................................30 b- Aspergillus flavi et la production des aflatoxines.....................................................32 b.1 A. flavus ..............................................................................................................32 b.2 A. parasiticus .......................................................................................................33 I-7.2. Le genre Penicillium...........................................................................................35 a- Définition...............................................................................................................35 b- Caractéristiques morphologiques ...........................................................................35 c- Penicillium verrucosum l’espèce ochratoxinogène .....................................................36 c.1 Définition ............................................................................................................36 c.2 Description morphologique...................................................................................36 c.3 Caractères microscopiques et macroscopiques générales.......................................38 I-8.Détection, identification et quantification des champignons mycotoxinogènes par méthodes moléculaires...............................................................................................38 a- Principe de la PCR .................................................................................................39 I-8.1 Les régions d'ADN cibles pour la détection et la quantification moléculaire des champignons mycotoxinogènes ..................................................................................39 a- L'ADN ribosomal nucléaire et mitochondrial ...........................................................39 b- Séquences des fragments obtenus par AFLP, RFLP, RAPD......................................40 c- Les régions d'ADN codant pour des mycotoxines.....................................................41 Ecotoxigénèse .....................................................................................................43 I-9. Facteurs physiques..............................................................................................44 I-9.1. La température .................................................................................................44 I-9.2 Activité de l’eau (Aw) ..........................................................................................45 I-10. Facteurs chimiques ...........................................................................................46 I-10.1 Composition gazeuse .......................................................................................46 I-10.2 Traitements agricoles.......................................................................................47 I-10.3 Nature du substrat ..........................................................................................47 I-11. Facteurs biologiques ..........................................................................................48 Contamination Alimentaire .................................................................................49 I-12. Origine des mycotoxines et produits contaminés ................................................50 I-12.1 Dans les céréales .............................................................................................51 I-12.2 Dans les oléagineux .........................................................................................52 I-12.3 Dans les fruits et légumes................................................................................52 I-12.4 Dans les viandes et produits de charcuterie .....................................................53 I-12.5 Dans le lait et les produits laitiers....................................................................53 I-12.6 Dans les autres produits..................................................................................54 I-13 Ochratoxine A et filière raisin..............................................................................54 I-14 Aflatoxine B1 et filière raisin ...............................................................................58 Réglementation et Législation.............................................................................59 I-15. Ochratoxine A....................................................................................................60 I-16. Aflatoxine B1 .....................................................................................................61 II- Matériel et Méthodes ......................................................................................65 II-1. Produits et Appareillage ......................................................................................66 II-2. Milieux de cultures .............................................................................................66 II-3 Méthodes.............................................................................................................70 II-3-1. Etude et analyse des vins finis libanais............................................................70 II-3-1.1 Collecte des échantillons................................................................................70 II-4. Dosage d’OTA .....................................................................................................72 II-4.1 Test ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay).........................................72 a- Principe .................................................................................................................72 b- Mode opératoire.....................................................................................................72 II-4.2 Dosage par HPLC..............................................................................................73 II-4.2.1 Extraction de l’OTA du moût et du vin après purification sur colonne d’immuno- affinité .......................................................................................................................73 a-Principe ..................................................................................................................74 b-Purification sur colonne d’immuno-affinité..............................................................74 II-4.2.2 Analyse de l’OTA par HPLC-FLD.....................................................................75 II-4.3 Dosage de l’AFB1..............................................................................................76 II-4.3.1 Extraction de l’AFB1 à partir du moût après purification par extraction liquide- liquide .......................................................................................................................76 a-Extraction à partir du moût ....................................................................................76 b-Extraction chloroformique.......................................................................................77 c-Concentration de l’extrait final ................................................................................77 II-4.3.2 Dosage de l’AFB1 par HPLC-FLD....................................................................77 II-5. Etude et caractérisation de la microflore fongique de raisins................................78 II-5.1 Echantillonnage des grappes de raisins.............................................................78 II-5.2 Isolement et identification de la microflore fongique ..........................................79 a- Isolement...............................................................................................................79 b- Identification .........................................................................................................79 b-1. Descriptif des champignons appartenant au genre Aspergillus ............................79 b-1.1 Le groupe des Aspergillus Nigri..........................................................................80 b-1.2 Le groupe des Aspergillus flavi ............................................................................... 81 b-2. Descriptif des champignons appartenant au genre Penicillium .............................81 c-1. Extraction de l’OTA et de l’AFB1..........................................................................82 II-5.3 Etude de la croissance et de la production d’AFB1 sur milieu SGM par des souches aflatoxinogènes de la section flavi.................................................................................... 83 II-6. Caractérisation génétique des souches de la section flavi ...................................... 83 II-6.1 Extraction rapide de l’acide nucléique fongique (ADN) .......................................83 a- Solution de lyse .....................................................................................................84 b- Extraction d’ADN ...................................................................................................84 II-6.2 La PCR (Polymerase Chain Reaction).................................................................85 a-Protocole.................................................................................................................85 II-6.3 Electrophorèse sur gel d’agarose .......................................................................86 a- Préparation du gel et migration ..............................................................................86 b- Analyse du gel .......................................................................................................86 III- Résultats et uploads/Science et Technologie/ my-coo-toxines.pdf