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Dossier scientiﬁque RÉSUMÉ L’étude des bactéries anaérobies connaît un regain d

Dossier scientiﬁque RÉSUMÉ L’étude des bactéries anaérobies connaît un regain d’intérêt du fait de la description de leur importance dans les micro- biotes et dans les processus infectieux. De nombreux outils commercialisés (milieux de transport, géloses et bouillons, systèmes assurant l’anaérobiose) permettent à ce jour leur culture à partir des échantillons cliniques. La spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, éventuellement complétée par le séquençage de l’ARN 16S, a révolutionné leur identification, y compris pour des espèces d’isolement moins fréquent, et diminué considérablement le délai de rendu des résultats. Les techniques phénotypiques conventionnelles, s’appuyant sur une série de tests facilement utilisables en routine et peu coû- teux (microscopie, tests biochimiques rapides et taxodisques) permettent d’identifier les principaux genres d’importance clinique et parfois les espèces mais impliquent un délai de réponse de 48 h Étant donné l’évolution de la résistance aux antibiotiques de certaines bactéries (Bacteroides, Parabacteroides, Prevotella, cocci à Gram positif anaérobie) il est souhai- table de tester leur sensibilité surtout dans le cadre d’infections monomicrobiennes ou d’infections mixtes impliquant des bactéries potentiellement résistantes. Les techniques de routine facilement utilisables et flexibles reposent actuellement essentiellement sur les bandelettes imprégnées d’un gradient d’antibiotique. La méthode de référence (dilution en gélose) est réservée aux laboratoires spécialisés. ABSTRACT Role of medical biology laboratory in the microbiological dia- gnosis of anaerobic bacteria There is a renewed interest in the study of anaerobes bacteria because of their role in microbiota and in infectious processes. Various commercially available systems (trans- port media, solid culture media and broth, systems providing suitable anaerobic envi- ronment) allow to isolate anaerobic bacteria successfully from clinical specimens. The use of matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry, eventually supplemented by 16S rRNA gene sequencing, has revolutionized identifi- cation of anaerobes, with quickly and accurately results even for unusual anaerobes. Conventional phenotypic techniques based on routinely usable and cost-effective tests (microscopy, rapid biochemical tests and special potency antibiotic disks) lead to an identification of main clinically relevant anaerobes at the genus level and sometimes at the species level but is time consuming. Because significative change in resistance patterns of many anaerobes (Bacteroides, Parabacteroides, Prevotella, anaerobe Gram positif cocci), antimicrobial susceptibility testing (AST) is recommended, especially in the case of monomicrobial infections or mixed infections incriminating potentially resistant bacteria. Methodology for easy and flexible routine AST of anaerobic bacteria is essentially based to date on the use of gradient strips. Agar dilution, considered as the reference standard for AST remains reserved for specialized laboratories. © 2018 – Elsevier Masson SAS Tous droits réservés. Rôle du laboratoire de biologie médicale dans le diagnostic microbiologique des bactéries anaérobies Yann Dumont1,2, Anne-Laure Michon1, Chrislène Laurens1, Lucas Bonzon1, Sylvain Godreuil1,2, Hélène Jean-Pierre1,* 1 Hôpital Arnaud de Villeneuve, CHU de Montpellier, Laboratoire de bactériologie, Université de Montpellier, 191 avenue du Doyen Gaston Giraud, 34295 Montpellier Cedex 5, France 2 UMR MIVEGEC IRD-CNRS-Université de Montpellier, IRD, Montpellier, France. *Auteur correspondant : h-jean_pierre@chu-montpellier.fr (H. Jean-Pierre) MOTS CLÉS ◗ antibiogramme ◗ bactéries anaérobies ◗ culture ◗ identification KEY WORDS ◗ anaerobic bacteria ◗ antibiogram ◗ culture ◗ identification 40 REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N° 505 • SEPTEMBRE-OCTOBRE 2018 Dossier scientiﬁque Les bactéries anaérobies Introduction Les bactéries anaérobies restent encore trop souvent les « mal aimées » et les « laissées pour compte » dans les laboratoires spécialisés en bactériologie. Plusieurs causes peuvent en être responsables : nature des échantillons parvenant au laboratoire, échantillons potentiellement contaminés par de la flore commensale, coût des milieux de transport et des techniques d’anaérobiose, culture plus lente, difficultés d’identification au sein des flores mixtes associant des bactéries aérobies ou aéro-anaérobies facultatives en l’absence de géloses sélectives, difficul- tés d’identification du genre et de l’espèce, absence de recommandations actuelles pour la réalisation en rou- tine de tests de sensibilité aux antibiotiques, et, en conséquence de l’ensemble de ces difficultés techniques, rendu tardif des résultats. Et pourtant les infections bactériennes incriminant des bacté- ries anaérobies seules ou en asso- ciation ne sont pas rares, voire même en augmentation du fait du nombre de plus en plus élevé de patients présentant des comorbi- dités (diabète, néoplasies, immu- nodépression). Les avancées tech- nologiques moléculaires actuelles ont permis de découvrir un grand nombre de bactéries anaérobies, la plu- part appartenant au microbiote digestif ou au microbiote oral, mais aussi des pathogènes émergents comme Atopobium deltae ou Eisenbergiella tayi [1]. Par ailleurs les bactéries anaérobies (surtout au sein des genres Bacteroides/Parabacteroides mais aussi des Prevotella et des cocci à Gram positif) ont acquis des résistances aux antibiotiques, certaines espèces de Bacteroides étant même rapportées comme multirésis- tantes, compromettant parfois les traitements anti-infec- tieux [2,3]. Ce chapitre a pour objectif de « dédramati- ser » la recherche de bactéries anaérobies au laboratoire de la culture à la réalisation de tests de sensibilité et d’encourager les microbiologistes à s’y intéresser. Les anaérobies : étape pré-analytique Avant d’entreprendre une recherche de bactéries anaé- robies il est essentiel de s’assurer de la qualité de l’échan- tillon. Les bactéries anaérobies sont abondantes voire prédominantes dans les différents microbiotes commen- saux (cavité orale, peau, tractus des voies aériennes supé- rieures, digestif, urogénital), et la majorité des infections les incriminant sont d’origine endogène, par rupture des barrières cutanéo-muqueuses. Le prélèvement doit per- mettre d’éviter une contamination par les microbiotes commensaux souvent très riches en bactéries anaéro- bies. Les échantillons prélevés par écouvillonnage de sites où ces microbiotes sont naturellement présents ne doivent pas faire l’objet d’une recherche de bacté- ries anaérobies : écouvillons de gorge, expectorations, aspirations endotrachéales ou bronchiques, écouvil- lons vaginaux, écouvillons réalisés en superficie d’une plaie chronique sans débridement ni décontamination cutanée, urines (à l’exception des urines prélevées par ponction sus-pubienne et des urines pyéliques), selles (à l’exception d’une recherche de Clostridium difficile ou dans le cadre de l’entérocolite ulcéro-nécrosante du nouveau-né). Par contre les échantillons de liquides ou de collections purulentes, d’abcès (de préférence préle- vés soit par ponction ou aspiration à l’aiguille, soit en per-opératoire), les biopsies tissulaires ou osseuses, les prélèvements pulmonaires protégés et les prélèvements pro- fonds de plaies chroniques doivent être mis en culture en anaérobiose. Pour tout échantillon destiné à la recherche de bactéries anaéro- bies, il faut éviter l’exposition à l’oxygène et au froid. Les milieux de transport pour anaérobies sont à privilégier, et sont même obligatoires si le prélèvement a été fait par écouvillon. Le transport se fait rapidement (idéalement en moins de 2 h mais reste acceptable sur milieu de transport jusqu’à 48 h) et à température ambiante. L’utilisation de flacons d’hémoculture doit être réservée aux liquides a priori monomicrobiens (liquide articulaire, liquide d’ascite) car, dans le cadre d’infections mixtes (pleurésie purulente et péritonites par exemple), ces flacons contenant des facteurs de croissance peuvent donner un avantage aux bactéries aéro-anaérobies de culture plus rapide. Il est alors préfé- rable d’utiliser des milieux de transport pour les liquides (type Portagerm®). La survie des bactéries anaérobies reste cependant possible au sein d’un pus de volume prélevé supérieur à 1 mL ou au sein d’une biopsie de plus de 1 cm3. Les anaérobies : étape analytique Examen direct L’examen direct par coloration de Gram peut per- mettre de reconnaitre des morphologies cellulaires évocatrices (longs bacilles à Gram négatif effilés pour Fusobacterium, bacilles à Gram positif trapus à bout car- rés pour Clostridium perfringens, filaments Gram positif branchés pour Actinomyces,…) ou montrer un polymor- phisme témoignant d’une infection polymicrobienne. Les avancées technologiques moléculaires actuelles ont permis de découvrir un grand nombre de bactéries anaérobies, 41 REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N° 505 • SEPTEMBRE-OCTOBRE 2018 REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N° 505 • SEPTEMBRE-OCTOBRE 2018 de leurs quantités respectives observés sur la gélose au sang anaérobie avec les résultats de la culture aérobie, et l’observation de colonies caractéristiques (Fusobacterium, Clostridium, colonies pigmentées de certaines Prevotella ou Porphyromonas,…), conduisent à suspecter ou non la présence de bactéries anaérobies. Il faut savoir à cette étape que certaines bactéries non classées dans les anaé- robies stricts peuvent en primoculture ne cultiver qu’en anaérobiose : les streptocoques « du groupe milleri » et notamment l’espèce S. constellatus, d’autres streptocoques (S. pyogenes, S. pneumoniae), Eikenella corrodens… De même certaines bactéries comme Pseudomonas aerugi- nosa (capable de respirer les nitrates), Haemophilus influen- zae (qui perd sa double dépendance en anaérobiose) et certains mycoplasmes (M. hominis, M. salivarium) peuvent cultiver sur une gélose enrichie au sang en anaérobiose. Si on suspecte la présence de bactéries anaérobies la décision de poursuivre l’analyse par des identifications et éventuellement des antibiogrammes dépend de la nature de l’échantillon et du polymorphisme bactérien observé. Il est possible dans certains cas de signaler simplement la présence d’une flore anaérobie polymorphe afin que le cli- nicien puisse en tenir compte dans le traitement éventuel instauré. Cependant, il est souhaitable, en particulier dans les processus infectieux développés aux dépens de la flore digestive endogène (liquides péritonéaux, abcès d’organes), d’identifier les Bacteroides du groupe fragilis et de contrôler leur sensibilité aux principaux antibiotiques utilisés dans ce contexte. En effet, c’est au sein de ce groupe que la résistance a le plus évolué. Dans des échantillons précieux (hémoculture, infection uploads/Science et Technologie/ role-du-laboratoire-de-biologie-medicale-dans-le-diagnostic-microbiologique-des-bacteries-anaerobies.pdf