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EPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE Ministère de l’Enseignement Supé

EPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique UNIVERSITE DES FRERES MENTOURI CONSTANTINE Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département de Biologie et Ecologie Végétale Filière : Biotechnologies préparer par : groupe 04 Gharbi abderraouf TP : Séparati on de protéine s par l’électro phorèse SDS- PAGE Le but : -Déterminer avec précision la présence d'une protéine spécifique dans un échantillon de protéines -Extrême un protéine (ADN) et séparer sur un gel polyacrylamide. Le Principe L'électrophorèse SDS-PAGE : est une technique consistant à faire migrer des protéines dans un gel, sous l'influence d'un champ électrique, permettant ainsi leur séparation Le matériel : -cassettes de gel polyacrylamide à 12 % précoulées type Preciseprotein gels (10 puits) -générateur pour électrophorèse de protéines -cuves à électrophorèse -systèmes d’assemblage pour gel d’électrophorèse -tubes Eppendorf 1,5 mL (préalablement stérilisés) -tube à hémolyse en verre avec bouchon à vis (préalablement nettoyés) -bain Marie commun à 95°C avec portoirs pour les tubes à hémolyse en verre. - Eprouvette de 200 mL. - Eprouvette de 2 litres (1 L à défaut). - Spatules inox. - Bacs de coloration en verre (ou cristallisoirs plats de grand format -boites de Pétri carré -boites de gants en latex -récipient à déchets de 5 L -flacon pour récupérer le tampon entre les deux groupes - Scalpel - Pince inox à bouts pointus -capsule de pesée -pipette automatique P10 + P20 + P200 + cônes jaunes pour P200 et P20 et cônes blancs pour P10. -Tampon de charge -Tampon de migration -1 litres de solution de coloration au bleu de Coomasie Marqueur de poids moléculaire Méthode 1 Extraction des protéines Ya 3 étape 1 Extraction avec azote liquide 2 purification 3 dénaturation 2 / Préparation de la cuve d’électrophorèse et du gel de polyacrylamide _ - 1 Placer le support de plaque de gel sur sa base. Verrouiller les deux loquets inférieurs pour une bonne stabilit _2 Ouvrir un sachet de gel en cassette prêt à l’emploi. Eliminer les excédents de tampon et bien essuyer les deux faces plastiques et Adapter la cassette de gel dans son support. Refermer avec le système de verrouillage en visant fermement mais sans excès. S’assurer que les joints plats en silicone assurent l’étanché 3 Si une seconde cassette de gel n’est pas utilisée, il faut placer sur l’autre côté du support une plaque de barrage. Placer la plaque en plexiglas en refermant avec le système de verrouillage dans les mêmes conditions que pour le gel 4-Dissocier le support de la base d’assemblage, puis insérer le support + cassette de gel dans la cuve à électrophorèse. S’assurer que le support est correctement bloqué dans les ergots de guidage : 3 : Préparation des gels : Préparer un gel de séparation (running gel) et Préparer un gel de concentration (stacking gel) 4 Remplissage de la cuve : 1 Remplir le compartiment intérieur (entre la cassette de gel et la plaque de barrage) avec 80 mL de tampon de migration pH 8. 2 -Remplir le compartiment principal de la cuve avec 1,5 L de tampon de migration pH 8, ju5 Chargement du gel • Le gel comporte en surface 10 puits matérialisés par des créneaux répartis sur la face supérieure du gelsqu’à atteindre environ 5 cm en dessous de la limite de remplissage (Max fill). 5 Chargement du gel • Le gel comporte en surface 10 puits matérialisés par des créneaux répartis sur la face supérieure du gel 6 Conditions de migration Après réalisation des dépôts, fermer la cuve à électrophorèse avec le couvercle porte- électrodes. S’assurer du bon verrouillage du couvercle. – Raccorder les électrodes au générateur, puis mettre en service. Choisir le mode manuel sur le générateur et régler les conditions de migrations 7-Récupération du gel -Après la fin de la migration, ouvrir le couvercle, sortir le bloc support + gel d’électrophorèse. Eliminer le tampon présent dans le compartiment interne dans un récipient à déchets. Le tampon présent dans la cuve principale doit être récupéré. -Démonter les différentes fixations pour récupérer la cassette de gel. -A ce stade, pour récupérer le gel, il faut séparer les deux plaques plastiques au sein desquelles il a été coulé. On utilisera une spatule inox pour faire levier entre les deux plaques. Attention : le gel est très fragile. Dès que les deux parties plastiques ont été séparées, plonger la face en plastique sur laquelle le gel est encore collé dans un bain d’eau distillée. Achever la séparation du gel sous l’eau, progressivement par mouvements d’oscillations 8-Coloration du gel - Une fois le gel libéré des plaques en plastique, le transférer dans un bac de coloration rempli d’une solution de bleu de Coomasie (environ 100mL). Laisser colorer pendant 45 minutes. -Après 45 minutes, vider la solution de coloration, rincer abondamment les restes de colorants à l’eau du réseau. Puis maintenir le gel sous un filet d’eau jusqu’à transparisation complète du fond du gel 9 Analyse des gels :Après transparisation, placer le gel sur une boite de Pétri plastique de 12 x 12 cm après Mesurer la distance de migration pour les différentes bandes obtenues (pour l’échantillon de référence et pour l’échantillon test, Et pour les différentes protéines du mélange étalon) Interprétation du gel -Cet interprétation est se fait par rapport au gel témoin DKs : absence des bandes B17s : présence des nouveaux bandes GGRs : absence de bande (97.0) (30.0)(14.4) RAHs : absence des bandes BEL : absence des bandes Vit : presence de bandes Ws : absence des bandes La courbe : Courbe de poids moléculaire par rapport au mobilité relative Poids moléculaire (kda) Log14.4= 1.15 Log20.1 =1.30 Log30 =1.47 Log45 =1.65 Log60= 1.77 Log97= 1.98 Distance D= 2.3 Chaque distance : d1= 0.6/d2=0.7/d3=0.4/d4=0.31/d5=0.2/d6=0.2 Conclusion : • L’électrophorèse SDS-PAGE, repose comme toute technique électrophorétique, sur la séparation de molécules chargées dans un champ électrique. Une cuve à électrophorèse est reliée à deux bornes (une cathode (-) et une anode (+)) alimentées par un générateur électrique : les molécules que l’on intercale dans ce champ migreront, selon leur charge, vers le pôle complémentaire. • La particularité de la SDS-PAGE est de soumettre les échantillons protéiques à un prétraitement dénaturant. Les protéines sont soumises à l’action de deux composés : -le β mercaptoéthanol : composé qui exerce une action dénaturante sur les protéines oligomériques en rompant les ponts disulfures ce qui désorganise leur structure tridimensionnelle. Les sous unités des protéines sont donc dissociées. -le SDS (sodium dodécyl sulfate) : c’est un composé capable de venir se fixer sur la périphérie des chaines de protéines tout en leur conférant une charge négative. Ainsi les protéines recouvertes par le SDS auront donc toutes une charge négative. Influencées ainsi par le SDS, elles migreront donc toutes vers l’anode (+) : la charge réelle des protéines n’est donc plus mise en jeu et donc seule leur masse moléculaire influencera leur migration. ! Cf Diaporama « Principe de la SDS-PAGE -On peut conclure qu’il existe un polymorphisme moyennement remarqué parce que les génotypes sont issue de la méme variété et les protéines différent entre les deux variéte uploads/Science et Technologie/ tp-separati-on-de-proteine-s-par-l-x27-electro-phorese-sds-universite-des-freres-mentouri-constantine.pdf