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Principes de la transgénèse végétale Application de la transgénèse végétale En

Principes de la transgénèse végétale Application de la transgénèse végétale En recherche fondamentale En recherche appliquée la transgénèse végétale Biotechnologie Ensemble de techniques biologiques, provenant de la recherche fondamentale, qui sont appliquées à la recherche et au développement de produits. La biotechnologie recouvre l'emploi de l'ADN recombinant, la fusion cellulaire et les nouveaux procédés biotechnologiques. La biotechnologie végétale est un domaine précis dans lequel des techniques scientifiques servent à mettre au point de nouvelles variétés de plante. la transgénèse végétale 1 Objectifs de la biotechnologie végétale * Produire de la biomasse cellules, tissus, organes, plantes - Utilisations variables: bio production, multiplication * Modifier le génotype d’une plante -introduire un nouveau caractère -supprimer un caractère préexistant la transgénèse végétale 2 La plupart des expériences de transgénèse végétale nécessite la culture in vitro Henri Duhamel du Monceau, des bourgeons apparaissent entre le bois et le cortex quand on enlève l’écorce Scleiden et Schwann: La théorie cellulaire: une cellule végétale différenciée peut devenir totipotente Totipotence: aptitude de la cellule végétale à exprimer la totalité des potentialités du génome pour donner un organisme entier Cette totipotentialité cellulaire s'accompagne d'une possibilité de multiplication indéfinie que l'on peut observer dans les zones de croissance de la plante : les méristèmes, cellules restant dans un état de dédifférenciation permanent. La culture in vitro la transgénèse végétale 3 dédifférenciation de la cellule végétale différenciée Mise au point de la culture in vitro à partir : - d’explant avec cellule méristématique (non différenciée, juvénile) Enchaînement de mitoses donne - une callogenèse - une organogenèse - une embryogenèse somatique - de tout type de tissus sans cellule méristématiques ( dédifférenciation-redifférenciation) La culture in vitro : les explants la transgénèse végétale 4 La culture in vitro : les régulateurs de croissance tryptophane AIA (photosensible) Les AUXINES dérivent d’un acide aminé: le tryptophane, exp: l’acide indole acétique Stimulation de l'élongation cellulaire, la division cellulaire et de l’organogenèse (rhyzogenèse). La synthèse de l'auxine s'effectue dans les apex des tiges, dans les méristèmes et dans les jeunes feuilles des bourgeons terminaux. Le transport de l'auxine s'effectue de façon polarisée, de l'apex vers la base dans la tige. la transgénèse végétale 5 LES CYTOKININES Stimule la division cellulaire (nom en relation avec cytokinèse ) et l’organogenèse (caulogenèse: bourgeon) Synthèse dans les racines puis migrent dans la plante via la sève brute Dérivent d’une base de l’ADN: l’adénosine la transgénèse végétale 6 En concentrations égales->division de cellules indifférenciées, callogenèse Formation de cals Auxines = Cytokinines Cellules végétales + auxines + cytokinines Rôle des auxines et des cytokinines dans la callogenèse la transgénèse végétale 7 Rôle des auxines et des cytokinines dans l’organogenèse Le rapport auxines / cytokinines détermine le devenir des tissus en culture la transgénèse végétale 8 Auxine formation de racines Cytokinines bourgeons Auxines majoritaires Cytokinines majoritaires La transgénèse végétale La galle du collet (crown gall ou « cancer des plantes » ) Viticulture, sylviculture problèmes Certaines bactéries infectent les cellules végétales et provoquent des tumeurs ou proliférations cellulaires chez les plantes infectées la transgénèse végétale 9 Smith et Townsend montrent en 1907 que le crown-gall est causé par une bactérie Agrobacterium tumefaciens Comment la bactérie entraîne une multiplication incontrôlée des cellules végétales ? Réponse trouvée par l’utilisation de la technique de culture in vitro la transgénèse végétale 10 Braun montre en 1943 que les cellules de la tumeur peuvent se multiplier indéfiniment en absence de bactéries et en absence de substances de croissance (auxines, cytokinines ). Prélèvement de cellules de la tumeurs et mise en culture in vitro en absence d’auxines et de cytokinines Productions de cals Propriétés des cellules de la tumeurs la transgénèse végétale 11 la transgénèse végétale 12 2) Croissance indépendante d’ajout d’hormones Les agrobactéries hébergent de très grands plasmides nécessaires à la formation des tumeurs A. Tumefaciens -> plasmide Ti Organisation du plasmide Ti (Tumor inducing) ADN circulaire extrachromosomique, autonomie de réplication, plusieurs exemplaires/Cel Bordures, séquences consensus la transgénèse végétale 13 Gènes de synthèse d’auxines et de cytokinines -ADN-T contient des gènes qui permettent - de produire des auxines et des cytokinines d’où une augmentation anormale des quantités d’hormones - la synthèse et la sécrétion d’opines Les plasmides Ti - 1 ou 2 ADN-T (ADN Transféré) la transgénèse végétale 14 Plasmide Ti à octopine Les gènes nécessaires au transfert du T-DNA sont portés par la zone vir (virulence) des plasmides Ti la transgénèse végétale 15 Dans le plasmide Ti, en dehors de la région de transfert et de la région vir Gènes impliqués dans les fonctions de : - réplication du plasmide (région ori) - de transfert conjugatif (région tar) Il y aurait 195 ORF: - 20 gènes impliqués dans la conjugaison - 3 gènes de réplication - 7 gènes de modification du plasmide - 22 gènes de pathogenèse - 38 gènes assurant le transfert de l’ADN-T - 24 gènes impliqués dans le métabolisme des opines - 12 gènes assurant des fonctions diverses telles que le transport de ribose, le chimiotactisme… - 84 séquences non répertoriées la transgénèse végétale 16 La transcription des gènes vir est induite par des composés phénoliques émis par les cellules blessées ex: acétosyringone Les inducteurs des gènes de virulence Egalement induction par monosaccharides (arabinose, fucose, xylose constituants de la paroi …) Induction par pH extracellulaire très bas (5 - 5,5) inhibition de la croissance bactérienne donc favorise le transfert de l’ADN-T la transgénèse végétale 17 Reconnaissance cellules végétales - bactéries composés phénoliques, monosaccharides Blessure Chimiotactisme, déplacement de la bactérie via son flagelle Fixation à la cellule végétale, récepteurs spécifiques à identifier Synthèse de filaments de cellulose Induction des gènes vir la transgénèse végétale 18 Modèle d’activation des gènes de virulence virA faible expression constitutive, chimiorécepteur membranaire et kinase VirG, faible expression constitutive, interagit avec boites vir dans région promotrice des opérons (12pb conservées), autorégulation de virG chvE nécessaire dans l’induction par les sucres monosaccharides autophosphorylation Souche hypervirulente = forte quantité de virG (quand croissance libre, peu de virG) la transgénèse végétale 19 Modèle de synthèse de l’ADN-T VIR D2 VIR D2 coupures Ici coupure simple brin d’où intermédiaire ADN-T simple brin, on peut avoir des coupures double brin et un intermédiaire ADN-T double brin, dépend des souches la transgénèse végétale 20 Vir D2 Vir D2 Vir D2 Vir D2 Vir D2 Vir D2 Modèle de synthèse de l’ADN-T VirD2 et VirE2 contiennent un signal de localisation nucléaire (NLS) Transfert dans le cytoplasme de la cellule, apparenté à une conjugaison de type bactérien Agrobactérie Membrane cellulaire cytosol Cellule végétale la transgénèse végétale 21 Modèle d’intégration de l’ADN-T dans l’ADN végétal Recombinaison non homologue ! Utilise la machinerie cellulaire 3’ 3’ = délétion de l’ADN génomique la transgénèse végétale 22 Intégration aléatoire dans le génome, plutôt régions transcrites Possibilité d’avoir plusieurs copies, nature des tissus, de la souche Des gènes du plasmide Ti de l’agrobactérie possèdent les éléments de régulation de la transcription par Pol II la transgénèse végétale 23 la transgénèse végétale 24 La transformation génétique comme outil de biotechnologie Système de transformation binaire R Structure d’un transgène p35S gène à exprimer pNos gène de sélection BG BD ADN-T la transgénèse végétale 25 R BD BG la transgénèse végétale 26 Agent de sélection Antibiotique kanamycine AUXINES = CYTOKININES CYTOKININES>>AUXINES Racine AUXINES>>CYTOKININES Bourgeon Cal Les étapes de la transformation génétique du tabac transformation Cellules Disques foliaires la transgénèse végétale 27 ou OGM ou PGM Transmission de l’ADN-T à la génération d’après Intégration aléatoire dans le génome Les étapes de la transformation génétique du tabac Applications de la transgénèse végétale 1) Etude des promoteurs 2) Etude de l’adressage des protéines 3) Recherche de la fonction des gènes -par complémentation ou par modification de leur expression (sur- expression ou sous-expression (RNAi prochain cours) ) -Par étude de mutants ‘perte de fonction’, production de mutants d’insertion Applications fondamentales la transgénèse végétale 28 Le gène marqueur de la B-glucuronidase de E.coli (GUS) 1) Étude de l’activité d’un promoteur BLANC BLEU la transgénèse végétale 29 1) Étude de l’activité d’un promoteur - Observations la transgénèse végétale 30 - Détails de la construction Promoteur à étudier ATG 5’ UTR STOP UTR 3’ Séq codante GUS Promoteur méristème spécifique Promoteur nervure spécifique Promoteur actif lors de la division cellulaire - Détails de la construction Fluorophore Promoteur à étudier ATG 5’ UTR STOP UTR 3’ Séq codante GFP PROTEINE GFP la transgénèse végétale 31 Promoteur racine spécifique Absorbtion Émission Marquage des noyaux avec une fusion NLS-GFP dans une plante transgénique GFP; Green fluorescent protein (Aequora victoria), protéine avec chromophore Émission à 508 nm Absorbtion à 395 nm 2) Etude de l’adressage des protéines la transgénèse végétale 32 3) Production de banques de mutants d’Arabidopsis thaliana par insertions d’ADN de Transfert la transgénèse végétale 33 3) Production de banque de mutants d’insertion d’ADN de transfert Plusieurs dizaines de milliers de transformants indépendants, donc d’insertions situées à différents emplacements dans le génome (0,1 à 3%) En général, obtention de mutants dits perte de fonction, mutation récessive la transgénèse végétale 34 la transgénèse végétale 35 CTGCAGACTTGAGTACAAGGGTGATGATGCGGACATTCTATCTGCTTA……... Gène X transgénèse, insertion au hasard du T-DNA uploads/Science et Technologie/ transgenese-vegetal-pdf.pdf