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BIOTECHNOLOGIE PHARMACEUTIQUE Dr CHIKH PLAN I- Généralités II- Production de bi

BIOTECHNOLOGIE PHARMACEUTIQUE Dr CHIKH PLAN I- Généralités II- Production de biomédicaments issus des biotechnologies III- Principaux biomédicaments. IV- Notion de « Biosimilaires » La biotechnologie a permis de découvrir et de développer une nouvelle génération de médicaments à usage humain. Grâce aux progrès réalisés dans le domaine de la biologie cellulaire et de la biologie moléculaire, les scientifiques ont identifié et développé tout un éventail de nouvelles thérapies. Ces molécules qui ont des effets cliniques significatifs ont rendu possible la mise à disposition de nouvelles avancées thérapeutiques pour des pathologies encore sans traitement connus. INTRODUCTION I - GÉNÉRALITÉS DÉFINITIONS Biotechnologie Les biotechnologies sont définies (OCDE) comme “l’application de la science et de la technologie à des organismes vivants, de même qu’à ses composantes pour modifier des matériaux vivants ou non vivants aux fins de la production de connaissances, de biens et de services”. OCDE: l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques Biomédicaments = Médicament biologique: Tout médicament dont la substance est produite à partir d’une source biologique ou en est extraite et dont la caractérisation et la détermination de la qualité nécessitent une combinaison d’essais physiques, chimiques et biologiques ainsi que la connaissance de son procédé de fabrication et de son contrôle . Biomédicaments Traditionnels: Extraction –D'origine animale: produits sanguins, hormones, stéroïdes, catécholamines, prostaglandines, anticorps, insuline, vaccins… –D'origine microbienne: antibiotiques, enzymes, protéases, vaccins, … –D'origine virale: vaccins Médicaments issus des biotechnologie: Médicaments faisant appel à une des procédés biotechnologiques suivants: Technique de l’ADN recombinant. Expression contrôlée de gènes codant pour des protéines biologiquement actives dans des procaryotes et eucaryotes, y compris des cellules transformées de mammifères. Méthodes à base d’hybridomes et d’anticorps monoclonaux. Biomédicaments Biotechnologie pharmaceutique Ensemble des procédés biotechnologiques utilisant des microorganismes, plantes et animaux ou leur constituants pour la production de produits pharmaceutiques Classification des biomédicaments Les biomédicaments apportent de plus en plus de solutions dans des pathologies souvent mal connues (maladies orphelines) ou des domaines limites en terme de traitements. Parmi ceux-ci on trouve différents domaines, comme la cancérologie et l’hématologie, l’endocrinologie, l’infectiologie, les troubles métaboliques (diabète), etc. Intérêt des Biomédicaments : • 1680: microscope: observation des cellules (Leuvwenhoek) • 1860- 1890 :Premiers procédés de culture cellulaire ( pasteur, Koch) • 1900-1920: Utilisation d’enzymes pour applications techniques, lessives (Rhom, Takamine) • 1929: Fleming, découverte de la pénicilline. • 1949: Début des transformations microbiennes à l’échelle industrielle Historique •1954: Structure de l’ADN par Watson et Crick •1973: Recombinaison génétique par Cohen et Boyer •1975: Anticorps monoclonaux (Kohler et Milstein) •1977 1er gène humain est cloné. •1978, le gène de l’insuline humaine est transféré dans la bactérie E. coli qui se met à produire une réplique de l’insuline de l’Homme. •1982: Commercialisation de l’insuline par Eli Lilly II- PRODUCTION DE BIO- BIOMÉDICAMENTS ISSUS DES BIOTECHNOLOGIES TECHNOLOGIE DE L’ADN RECOMBINANT Principe: Basé sur des techniques de biologie moléculaire permettant de: – Couper l’ADN de manière définie et reproductible, à l’aide d’enzymes de restriction – Intégrer l’ADN dans des vecteurs, molécules d’ADN utilisée comme outils de transfert de matériel génétique dans une cellule hôte – Transcrire in vitro un ARNm en séquence d’ADNc à l’aide de la transcriptase inverse • Éliminer le problème de disponibilité des ressources en vue d’extraire les protéines ( interféron) • Éviter les problèmes de sécurité et transmission des maladies à partir des sources naturelles biologiques( produits dérivés du sang) • Donner une alternative aux extractions directes à partir des sources inadéquates ou dangereuses ( FSH à partir des urines, venin des serpent) • Possibilité de changement dans la structure d’une protéine pour donner naissances à de nouvelles entités ayant des avantages par rapport à la protéine d’origine ( insuline rapide) AVANTAGES DES TECHNOLOGIES DE L’ADN r ÉTAPES D’OBTENTIONS DE L’ADNr • Source d’ADN humain :en général les leucocytes • 5 à 10 ml de sang =>20 µg d’ADN sous la forme de fragments de taille supérieure à 20 kbp • Prélèvement : sang avec un anticoagulant (comme l’EDTA) • Mélanger à une solution hypotonique=>éclater les hématies dépourvues de noyaux. • Centrifugation=>récupération des leucocytes • Traitement par des détergents ioniques( SDS): désorganisation de la double couche de phospholipides membranaires => libération du contenu cytoplasmiques et nucléaires. OBTENTION DE L’ADN À MANIPULER Extraction, précipitation de l’ADN génomique: • Traitement par la protéinase K=>libérer le DNA nucléaire en digérant les histones qui lui sont associées • L'élimination des protéines non digérées et des lipides: se réalise par des précipitions et des extractions ( mélange de phénol-chloroforme) • Récupération de la phase aqueuse ( contenant les acides nucléiques • précipitation sélective (éthanol ou isopropanol) + centrifugation => récupération des acides nucléiques • Elimination de l’ARN : par addition de Ribonucléase Coupure de l’ADN par les enzymes de restriction • Ces enzymes appartiennent au système de défense bactérien nommé système de restriction-modification. • Elles protègent les bactéries de l’introduction d’ADN étranger en le digérant. • Les enzymes de restriction utilisées en génie génétique sont des Endonucléases spécifiques, de type II pour la plupart, qui reconnaissent des séquences symétriques de quatre à six paires de bases et coupent la molécule double brin au niveau de ces sites. FRAGMENTATION DE l’ADN Isolement des fragments d’ADN: • Séparation des fragments d’ADN par électrophorèse sur gels d’agarose ou de polyacrylamide . Leur vitesse de migration dépend de leur poids moléculaire. • Le fragment d’intérêt peut être repéré par hybridation selon la méthode de SOUTHERN BLOT. LES VECTEURS ADN plasmidique: • Les plasmides sont de petites molécules d'ADN bicaténaires, circulaires, extra-chromosomiques, susceptibles de se répliquer de façon autonome . • Ils sont présents dans le cytoplasme de nombreuses espèces. • Ils peuvent porter des gènes de résistances aux antibiotiques ce qui permet la sélection de bactéries possédant le plasmide. ADN phagique: • Les phages sont des particules virales qui infectent les bactéries. • Leur multiplication est rapide et le nombre de copies par cellule bactérienne est très important. • Deux types de phages qui infectent E coli sont d'usage fréquent : le phage λ et le phage M13. o Phage λ: - Constitué d'un ADN double brin linéaire de 48.502 paires de bases. - Les extrémités appelés COS sont constituées par de l'ADN sous forme simple brin sur une longueur de 12 bases. o Phage M13: Constitué d’une molécule d'ADN circulaire monocaténaire de 6407 paires de bases Autres vecteurs: o Cosmides : vecteurs hybrides constitués d’un plasmide classique auquel ont été ajoutées les séquences COS du phage λ . o YAC: Chromosome artificiel de levure • Les fragments d’ADN peuvent être associés pour former un ADN recombinant, grâce à des ADN ligases. • Elles catalysent la formation de liaison covalente entre les Construction de l’ADNr extrémités cohésives des fragments ayant été soumis à des enzymes de restriction. Amplification de l’ADN r obtenu : Insertion de l’ADNr à une cellule hôte (transformation): Bactéries rendues compétentes par : Traitement chimique Electroporation : choc électrique 30 Mélange de bactéries transformées contenant le plasmide d'intérêt et de bactéries non transformées Étalement des bactéries sur une boîte contenant un milieu gélosé et un antibiotique : seules les bactéries transformées pourront se multiplier car le plasmide porte un gene de résistance contre l'antibiotique Colonie de bactéries transformées Sélection des bactéries transformées : Leur multiplication s’accompagne de la réplication du plasmide qui se répartit dans les cellules filles, ce qui assure l’amplification du fragment d’ADN inséré. • ADN r peut être introduit dans une cellule hôte via un vecteur = clone cellulaire. • La cellule hôte peut être : une cellule bactérienne (E.coli, Bacillus subtilis, etc.), une levure, un champignon filamenteux, une cellule végétale, une cellule de mammifères ( CHO ), etc. Cellules hôtes Le clonage dans E. coli s’avère techniquement plus facile que dans un autre organisme car: Il n’y a pas de modification post- traductionnelle, Sa carte génétique est bien connue Facile a cultiver La cellule hôte ayant reçu l’ADN recombinant va pouvoir synthétiser la protéine correspondante sur le modèle habituel, c'est- a-dire en faisant intervenir les étapes de transcription et de traduction. Culture cellulaire: consiste à faire développer des cellules en laboratoire dans des conditions contrôlées. Cultiver de grandes quantités de cellules Production de la protéine recombinantes Bioréacteurs : une production à grande échelle Un bioréacteur est une enceinte, de 2 à 100 000 litres permettant la culture de tout type de cellules (animale, végétale, levures, bactéries) et répondant a des critères de conception permettant d’influer efficacement sur la culture, de contrôler et piloter les paramètres physiques et chimiques: pH Température Composition du Milieu Agitation Aération Asepsie Paramètre à maitriser: Purification de la protéine synthétisée: • Consiste à filtrer et centrifuger les protéines extraites pour éliminer les débris cellulaires et les particules indésirables ce qui permet de concentrer les protéines. • Plusieurs étapes: Séparation: séparer les cellules du surnageant et conserver la fraction d’intérêt oCentrifugation oMicro-filtration (0,1-0,45 um) Homogénéisation: => briser les cellules pour récupérer un produit intra- cellulaire Concentration: Réduire le volume: oPrécipitation oUltra-centrifugation. oUltra-filtration (5kDa - 500kDa) Purification: Isoler le produit d’intérêt Chromatographie Schéma général de purification des protéines III-PRICIPAUX BIOMÉDICAMENTS ISSUS DES BIOTECHNOLOGIE Les anticorps monoclonaux Sont uploads/Science et Technologie/biotechnologie-pharmaceutique-cours-de-galenique-pharmaceutique-3em-annee-pharmacie-dr-chikh.pdf