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Auteur : Bruno Flamand, IUT de Dijon Cours d'Hémato-cytologie DUT ABB 4- automa

Auteur : Bruno Flamand, IUT de Dijon Cours d'Hémato-cytologie DUT ABB 4- automatisation de l'Hémogramme CYTOLOGIE HEMATOLOGIQUE L’HEMOGRAMME englobe: -les numérations des éléments figurés -le dosage de l’Hémoglobine -la mesure de l’Hématocrite -le calculs des constantes érythrocytaires et plaquettaires -l’établissement de la formule leucocytaire Prélèvement: sang veineux sur EDTA (ou citrate de Na), éventuellement sang capillaire L’Hémogramme est automatisé complètement ou partiellement dans les laboratoires •Numérations: GR, GB, Plaquettes. •Valeurs et constantes: -érythrocytaires: -Taux Hémoglobine sanguin Hb -Hématocrite Ht -Volume Globulaire Moyen VGM -Concentration Corpusculaire Moyenne en Hb CCMH -Taux Corpusculaire Moyen en Hb TCMH -Indice de Distribution des Rouges IDR -plaquettaires: -Thrombocrite THT -Volume Plaquettaire Moyen VPM Indice de Distribution Plaquettaire IDP •Formule leucocytaire: répartition des différentes sous-populations de leucocytes: PN, PE,PB,L,M -FL manuelle par lecture microscopique de frottis coloré au MGG (100 à 200 leucocytes répertoriés), si anomalie de FL automatisée -FL automatisée (5000 à 10000 leucocytes répertoriés) Les résultats sont rendus en valeur relative % et en valeur absolue par mm3, mais l’interprétation n’est valable que sur les valeurs absolues •GR, Hb, Hte,VGM,TCMH,IDR: orientation du diagnostic des anémies •Plaquettes: diagnostic des pb d’hémostase primaire •GB, FL: diagnostic des pb infectieux, inflammatoires, leucémiques L’Hémogramme: NFS Numération Formule (leucocytaire) Sanguine Anciennes unités Facteur x Unités internationales Globules rouges 106 par mm3 106 T/L (téra, 1012) Hémoglobine g/100 ml 0,621 mmol/L Hématocrite % ou dl/dl 0,01 L/L VGM µ3 F/L (femto,10-15) TCMH pg 0,062 fmol (femto,10-15) CCMH % ou g/100ml 0,062 mmol/L Globules blancs 103 par mm3 106 G/L (giga, 109) Plaquettes 103 par mm3 106 G/L (giga, 109) GR Homme 4,5 à 6 .106 /mm3 Femme 3,8 à 5,5 .106 /mm3 Hématocrite Homme 40 à 54 % Femme 37 à 47 % Hémoglobine Homme 13 à 17 g/100ml Femme 12 à 16 g/100ml VGM 82 à 98 fl CCMH 32 à 36 % TCMH > 27 pg IDR <15 % Plaquettes 150 000 à 450 000 /mm3 GB 5000 à 10 000 /mm3 Granulocyte neutrophile 1500 à 7000 /mm3 Granulocyte éosinophile 0 à 400 /mm3 Granulocyte basophile 0 à 100 /mm3 Lymphocyte 1500 à 4000 /mm3 Monocyte 200 à 800 /mm3 Défaut Paramètres Excès Erythropénie GR Polyglobulie Hemodilution Hématocrite Hemoconcentration Anémie Hémoglobine Microcytose VGM (Normocytose) Macrocytose Hypochromie CCMH* Hypochromie TCMH (Normochromie) IDR Anisocytose Thrombopénie Plaquettes HyperThrombocytose Leucopénie GB Hyperleucocytose Neutropénie Granulocyte neutrophile Polynucléose neutrophile Granulocyte éosinophile Hyperéosinophilie Granulocyte basophile Basocytose Lymphopénie Lymphocyte Hyperlymphocytose Monocytopénie Monocyte Monocytose *La CCMH est considérée comme un indice moins sensible de l’hypochromie que la TCMH dans les anémies, en effet la TCMH diminue avant la CCMH dans l’installation d’un cas d’anémie Automatisation de l'hémogramme La chronologie par étapes 1980 1954 1972 1994 1990 2000 Semi Auto GB Plt VGM GR Hb Hte Automates Numération Formule 3 pop. Formule 5 populations 7 par. - Plt 8 par. (+ Plt) 18 par. (HD) 22 par. + + (NFS) Rétic. Etaleur/Colorateur Pentra 120 Retic Horiba-ABX Pentra 60 Horiba-ABX CELL-DYN 3700 Abbot Laboratories CELL-DYN SMS Abbot Laboratories ACT 5DIFF Beckman Coulter Coulter HMX Beckman Coulter Sysmex XT LH 1500 Series Automation Beckman Coulter CELL-DYN WorkCell Abbott Laboratories Deux principes très différents: LA NUMERATION DES TROIS LIGNEES GR, GB, PLT •La Variation d’impédance Principe Coulter du nom des inventeurs (Wallace and Joe Coulter- 1953), Méthode de référence, la plus répandue. Utilisée pour les numérations, et la formule leucocytaire approchée. •La mesure optique Associe les principes de bases de la Cytométrie en Flux (1977): -focalisation hydrodynamique -diffraction lumineuse recueillie à différents angles /incidence Utilisée surtout pour la numération des GB associée à la FL, cependant quelques automates utilisent la mesure optique pour les numérations des 3 lignées GR, GB, PLT (Bayer automate ADVIA 120, Sysmex automate XT2000) La variation d'impédance Principe Coulter Electrode interne Electrode externe Flux de diluant conducteur Vide régulé Temps U Bac de comptage I= constante Saphir percé d’un micro- orifice Diamètre 4mm Micro-orifice, surface s U= R I et R = r l / s Impulsion La valeur de l’impulsion de tension U est proportionnelle au volume cellulaire r: résistivité et l: largeur 1 impulsion U = 1 particule Construction des histogrammes de distribution volumétrique: 1-amplification des impulsions (µV en mV) 2-tri des impulsions selon des seuils électroniques 3-Répartition des impulsions dans des canaux électroniques (256 ou 128) en fonction du niveau d’impulsion donc du volume cellulaire 4-comptage des impulsions dans un intervalle de volume cellulaire U = f(volume cellulaire) Seuil Histogramme de distribution volumétrique Numération des Globules Rouges et des Plaquettes Bac de comptage des GR/PLT • Comptage et mesure du volume à partir d'une suspension cellulaire diluée en solution isotonique: taux de dilution élevé (1/10 000 à 1/20 000 ), ce qui permet de rendre négligeable une interférence des GB • Un seul bac de comptage: • Toute particule d'un volume supérieur à 25 fl (et inférieur à 250 fl) est comptée comme un GR • Toute particule d’un volume supérieur à 2 fl (et inférieur à 25 fl) est comptée comme une PLT • Chaque particule est placée dans un histogramme de distribution volumétrique Numération des Globules Rouges Histogramme des GR Mise en évidence de fragments de cytoplasme ou de grandes plaquettes par l'analyse de l'histogramme à partir de 24 fl. La trainée peut correspondre aux : –Passages en coïncidence –Agrégats cellulaires –Cellules agées –Globules blancs VGM Numération des Globules Rouges Les paramètres calculés • L'IDR ou RDW (Red Cell Distribution Width) L'IDR est une valeur statistique correspondant au CV % calculé sur la distribution des rouges = coefficient d'anisocytose. 50 100 200 100 200 50 50 100 200 IDC Normal< 15% IDC Elevé 18 % IDC très Elevé 35 % Double population • Ht = Hématocrite Ht = (GR 10 6/mm3 x VGM fl ) / 10 • TCMH = Teneur cellulaire moyenne en hémoglogine. TCMH en pg = (Hb g/100 ml / Nb GR) x 10 • CCMH = Concentration cellulaire moyenne en hémoglobine. CCMH en % = (Hb en g/100 ml / Nb GR 10 6/mm3 x VGM) x 1000 Numération des Plaquettes Histogramme des PLT et paramètres calculés VMP Grandes Plaquettes > 20 fl Petites plaquettes, débris ? < 2 fl • Le Thrombocrite – TCT ou THT %= (VMP fl x Nb de Plaquettes 10 3/mm3 ) x 1000 • L'IDP ou PDW – Indice de distribution plaquettaire CV % sur la distribution volumétrique des PLT= coefficient d’anisocytose plaquettaire Numération PLT Existent des seuils variables permettant élimination risques d’interférences et numérations justes Grandes plaquettes GR microcytaires Petites plaquettes Débris Shizocytes Numération des globules blancs Bac de comptage des GB • Comptage à partir d'une suspension cellulaire diluée en liquide hémolytique: taux de dilution faible, (1/200 à 1/300) • Un bac de comptage réservé • Toute particule d'un volume supérieur à 35 fl est comptée comme un globule blanc. • Les globules rouges sont lysés (ammonium quaternaire, ferri cyanure, cyanure de K+), permet la libération de Hb CyanMetHb • Une partie de la dilution des leucocytes passe dans une cuve spectrophotométrique pour la mesure à 540 nm Source lumineuse LED Cuve de mesure Filtre Photo-détecteur • Le résultat de numération est assujeti à une correction dite "correction de coïncidence". • Occasionnellement deux ou trois cellules peuvent traverser l'orifice de comptage en même temps. • Une impulsion de grande amplitude est générée. • La fréquence de ces passages en coïncidence est statistiquement prévisible en fonction du nombre de cellules. Cette correction est réalisée automatiquement par les analyseurs. Correction de passage en coïncidence Doublet ou triplet cellulaires Temps U LA FORMULE LEUCOCYTAIRE automatisée TROIS POPULATIONS ou CINQ POPULATIONS (5 Diff) •La formule leucocytaire 3 populations ou formule approchée, (GRA / Lympho / Mono): pour la majorité des automates, elle est réalisée par analyse par variation d’impédance des volumes cellulaires des globules blancs, après lyse des GR, et action différentielle d’une lyse ménagée sur les GB, lyse qui modifie leur volume. Cette FL approchée n’a pas de valeur légale, et très peu de valeur fonctionnelle, un automate de ce type décharge l’automate principal du passage de sangs de patients sans anomalie •La FL complète ou 5 populations, permet en associant plusieurs principes technologiques, l’analyse des GN, GE, GB, M, L, et le repérage facilité de populations anormales du sang (lymphocytes atypiques, cellules immatures précurseurs, érythroblastes…) Il est des circonstances où il faut effectuer obligatoirement une formule au microscope, et ne pas se contenter de la formule de l’automate: •FL du nouveau-né •Premier examen d’un malade avec nettes anomalies de numération •Variations brutales et inexpliquées par rapports aux NF antérieures •Incohérence avec le contexte clinique ou thérapeutique •Alarmes de l’automate pour lesquelles il n’y a pas d’explication évidente au vu du dossier et/ou des examens antérieurs •Alarmes de l’automate pour distribution cellulaires inhabituelles sur les graphes Formule 3 populations Rôle de la lyse différentielle (Cytolyse ménagée) La membrane devient semi- perméable Le contenu cytoplasmique est libéré La membrane cytoplasmique se rétracte autour du noyau et des granulations Le volume final dépend de la taille du noyau, de sa lobularité et des granulations. Histogramme différentiel volumétrique de GB Détermination de 3 sous-populations Reconnaissance des uploads/Sante/ 4-automatisation-hemogramme 3 .pdf