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Colorations et examen microscopique

MODE OPERATOIRE Colorations et Examen microscopique MO -MYC- Rév A Indice de révision A Nature de la modi ?cation Création P Sommaire I - Objet II - Réactifs III - Méthodologie IV - Lecture des lames V - Notation des résultats VI - Annexes Rédigé par Date Signature Véri ?é par Date Signature Approuvé par Pour application le Signature I - Objet Ce document détaille les protocoles de coloration et d'examen microscopique des frottis colorés pour la recherche et l'observation des mycobactéries II - Réactifs Se reporter en annexes du document III - Méthodologie A - Préparation des frottis B - Fixation C - Colorations - Méthodes utilisant la fuchsine - Méthodes utilisant l'auramine - Méthode utilisant l'acridine orange A - Préparation des frottis - Graver au diamant sur la lame le N du prélèvement correspondant - A partir du prélèvement parcelle purulente si possible faire un frottis ?n sur les de la lame un frottis ?n permet de voir à travers les lettres noires d'une page imprimée trop épais le frottis se décolle - A partir du culot de centrifugation faire un frottis sur une surface de x cm NB Si le frottis est fait à partir du acon Bactec B ml de culot est ajouté à ml de sérum de lapin B - Fixation - Laisser sécher le frottis à l'air ou sur une plaque chau ?ante à température moyenne - Fixer à l'alcool méthylique C - Colorations Plusieurs techniques sont utilisées pour colorer les mycobactéries présentes dans les prélèvements - Méthodes utilisant la fuchsine - Méthodes utilisant l'auramine - Méthode utilisant l'acridine orange CRemarques Pour toutes les colorations le rincage à l'eau se fait sous un ?let d'eau de robinet Le séchage entre épaisseurs de papier ?ltre est à éviter - Méthodes utilisant la fuchsine - Coloration de Ziehl-Neelsen à chaud Réactifs Fuchsine de Ziehl RAL Acide nitrique au Alcool à Bleu de méthylène Technique - Couvrir la lame de fuchsine phéniquée - Chau ?er trois fois en minutes jusqu'à émission de vapeurs le colorant ne doit pas bouillir ou se déssécher sur la lame en ajouter si nécessaire - Rincer à l'eau - Couvrir la lame d'acide nitrique dilué au Laisser agir secondes - Rincer à l'eau - Couvrir la lame d'alcool éthylique à Laisser agir mn - Rincer à l'eau - Recouvrir la lame de bleu de méthylène Laisser agir mn - Rincer à l'eau - Laisser sécher à l'air libre Remarques La coloration de Ziehl-Neelsen peut être faite à froid Les lames sont immergées pendant au moins heures dans la solution de fuchsine On peut utiliser l'acide sulfurique dilué au à la place de l'acide nitrique On peut avantageusement remplacer les deux temps de la décoloration par l'utilisation d'un mélange acide-alcool que l'on laissera agir pendant minutes Le réactif d'Armand qui contient l'acide l'alcool et le bleu de méthylène permet de réaliser en un seul temps la décoloration et la recoloration des frottis préalablement colorés par la fuchsine - Coloration de Kinyoun Réactifs Fuchsine