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Attendus tp TP SV Génie-génétique Introduction Le but de ce TP est de cloner le fragment d ? ADN humain de la béta-actine une protéine qui combiné à la myosine sert à la contraction musculaire Pour cela nous allons insérer le fragment d ? ADN dans le plas

TP SV Génie-génétique Introduction Le but de ce TP est de cloner le fragment d ? ADN humain de la béta-actine une protéine qui combiné à la myosine sert à la contraction musculaire Pour cela nous allons insérer le fragment d ? ADN dans le plasmide PUC et le mettre dans la bactérie E coli a ?n qu ? elle réplique le plasmide indépendamment de son propre génome ensuite nous allons étudier les clones du plasmide des bactéries recombinées Premièrement nous allons faire une digestion enzymatique du plasmide ainsi qu ? une déphosphorylation a ?n de préparer le plasmide à se lier au fragment d ? ADN Puis nous allons faire une ligature pour lier le fragment d ? ADN avec le plasmide ensuite nous allons faire une transformation bactérienne a ?n de rendre la bactérie E coli compétente qui est capable d ? accepter le plasmide et de le répliquer E coli va ensuite cloner le fragment d ? ADN Nous allons étudier les clones des bactéries recombinées avec le fragment d ? ADN de béta- actine en utilisant la méthode de la PCR et celle de la digestion enzymatique de l ? ADN plasmidique puri ?é Etapes du clonage La digestion enzymatique Le but de cette étape est de linéariser le plasmide avec l ? enzyme de restriction EcoRI G AATTC pour cela on incube à C une solution de plasmide PUC avec l ? enzyme de restriction EcoRI une solution tampon et de l ? eau Une fois la digestion enzymatique terminé il faut neutraliser EcoRI pour qu ? elle ne gène pas la suite des manipulations en mettant la solution à une température de C pendant minutes A la ?n de la manipulation la solution ne devrait contenir que des plasmides linéaires de paires de bases pour véri ?er ça on peut faire un gel d ? agarose pour déterminer le poids des fragments d ? ADN présents dans la solution En théorie on devrait avoir ce résultat Ici PM correspond au marqueur de poids de référence Le trait à côte correspond à la migration des fragments d ? ADN de la solution La déphosphorylation Le but de cette étape est d ? empêcher le plasmide de retrouver une forme circulaire en enlevant un phosphate sur l ? extrémité ? Pour cela on ajoute de la phosphatase dans le milieu réactionnel et on incube à C puis on inactive la phosphatase avec un choc thermique à C On conserve le milieu réactionnel dans la glace CAprès la déphosphorylation il ne devrait y avoir dans la solution que des fragments d ? ADN linéaire de pb et aucun fragment circulaire Si on refait un gel d ? agarose le résultat devrai être le même qu ? avant la manipulation La ligature Le but de la ligature est de lier le fragment d ? ADN de la béta-actine au plasmide PUC dans l ? expérience nous allons faire ligatures di ?érentes une avec l ? insert le vecteur