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Tp separati on de proteine s par l x27 electro phorese sds universite des freres mentouri constantine

EPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE Ministère de l ? Enseignement Supérieur et de la Recherche Scienti ?que UNIVERSITE DES FRERES MENTOURI CONSTANTINE Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Département de Biologie et Ecologie Végétale Filière Biotechnologies TP Séparati on de protéine s par l ? électro phorèse préparer par Gharbi abderraouf SDS - groupe PAGE CLe but -Déterminer avec précision la présence d'une protéine spéci ?que dans un échantillon de protéines -Extrême un protéine ADN et séparer sur un gel polyacrylamide Le Principe L'électrophorèse SDS -PAGE est une technique consistant à faire migrer des protéines dans un gel sous l'in uence d'un champ électrique permettant ainsi leur séparation Le matériel - cassettes de gel polyacrylamide à précoulées type Preciseprotein gels puits -générateur pour électrophorèse de protéines -cuves à électrophorèse -systèmes d ? assemblage pour gel d ? électrophorèse -tubes Eppendorf mL préalablement stérilisés -tube à hémolyse en verre avec bouchon à vis préalablement nettoyés -bain Marie commun à C avec portoirs pour les tubes à hémolyse en verre Eprouvette de mL Eprouvette de litres L à défaut Spatules inox Bacs de coloration en verre ou cristallisoirs plats de grand format C-boites de Pétri carré -boites de gants en latex -récipient à déchets de L - acon pour récupérer le tampon entre les deux groupes Scalpel Pince inox à bouts pointus -capsule de pesée -pipette automatique P P P cônes jaunes pour P et P et cônes blancs pour P -Tampon de charge -Tampon de migration - litres de solution de coloration au bleu de Coomasie Marqueur de poids moléculaire Méthode Extraction des protéines Ya étape Extraction avec azote liquide puri ?cation dénaturation Préparation de la cuve d ? électrophorèse et du gel de polyacrylamide - Placer le support de plaque de gel sur sa base Verrouiller les deux loquets inférieurs pour une bonne stabilit Ouvrir un sachet de gel en cassette prêt à l ? emploi Eliminer les excédents de tampon et bien essuyer les deux faces plastiques et Adapter la cassette de gel dans son support Refermer avec le système de verrouillage en visant fermement mais sans excès S ? assurer que les joints plats en silicone assurent l ? étanché ? ? ? ? ? ? C Si une seconde cassette de gel n ? est pas utilisée il faut placer sur l ? autre côté du support une plaque de barrage Placer la plaque en plexiglas en refermant avec le système de verrouillage dans les mêmes conditions que pour le gel -Dissocier le support de la base d ? assemblage puis insérer le support cassette de gel dans la cuve à électrophorèse S ? assurer que le support est correctement bloqué dans les ergots de guidage Préparation des gels Préparer un gel de séparation running gel et Préparer un gel de concentration stacking gel Remplissage de la cuve Remplir le compartiment intérieur entre la cassette de gel et la plaque de barrage avec mL de tampon de migration pH -Remplir le compartiment principal