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CONSEIL OLÉICOLE INTERNATIONAL Príncipe de Vergara, 154 – 28002 Madrid – España

CONSEIL OLÉICOLE INTERNATIONAL Príncipe de Vergara, 154 – 28002 Madrid – España Telef.: +34 915 903 638 Fax: +34 915 631 263 - e-mail: iooc@internationaloliveoil.org - http://www.internationaloliveoil.org/ MÉTHODE D’ANALYSE ÉVALUATION DE LA COHÉRENCE ENTRE LA COMPOSITION EN TAG ET LA COMPOSITION EN ACIDES GRAS 1. OBJET La méthode est utilisée pour vérifier la cohérence entre la composition en triacylglycérols des huiles d’olive et leur composition en acides gras. La composition théorique en triacylglycérols calculée à partir de la composition en acides gras est similaire dans l’huile d’olive à la composition expérimentale en triacylglycérols. La méthode indique seulement si la composition en triacylglycérols de l’huile d’olive est cohérente ou non cohérente. 2. PRINCIPE La composition expérimentale en triacylglycérols (TAG) est comparée à la composition théorique obtenue à partir de l’analyse des esters méthyliques d’acides gras (FAME). L’huile est purifiée par extraction en phase solide (SPE) sur des cartouches de gel de silice. La composition en TAG est déterminée par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) au moyen d’un détecteur d’indice de réfraction et du propionitrile comme phase mobile. Les FAME sont préparés à partir d’une huile purifiée par méthylation à froid dans une solution méthanolique d’hydroxyde de potassium (KOH) puis les esters sont analysés par chromatographie gazeuse capillaire au moyen d’une colonne de polarité élevée (COI/T.20/Doc. Nº 33/ Rév. 1). La composition théorique en TAG est calculée à partir de la composition en acides gras au moyen d’un logiciel informatique basé sur une distribution aléatoire 1, 3, 2 des acides gras dans le triacylglycérol, avec des restrictions pour les acides gras saturés en position 2. La méthode de calcul est une modification de la procédure décrite dans le document COI/T.20/Doc. Nº 20. Des algorithmes mathématiques sont calculés à partir de compositions théoriques et expérimentales en TAG et les valeurs obtenues sont comparées à celles d’une base de données élaborée à partir d’huiles d’olive authentiques. COI/T.20/Doc. Nº 25/Rév.2 2018 FRANÇAIS Original : ANGLAIS COI/T.20/Doc. Nº 25/Rév.2 page 2 3. MATÉRIEL ET RÉACTIFS 3.1. Purification de l’huile 3.1.1. Fioles coniques de 25 mL de capacité. 3.1.2. Éprouvettes de 5 mL de capacité à bouchon vissant muni d’un joint en PTFE. 3.1.3. Cartouches de gel de silice, 1 g (6 mL), pour extraction en phase solide. 3.1.4. n-Hexane de qualité analytique. 3.1.5. Éther diéthylique de qualité analytique. 3.1.6. Mélange de solvant hexane/éther diéthylique (87:13, V/V). 3.1.7. n-Heptane de qualité analytique. 3.1.8. Acétone de qualité analytique. 3.2. Analyse des triacylglycérols par HPLC 3.2.1. Microseringues (50 µL) et aiguilles pour injection dans la colonne HPLC 3.2.2. Propionitrile, de haute pureté ou pour HPLC, comme phase mobile. 3.2.3. Colonne HPLC (25 cm x 4 mm i.d.), avec phase RP-18 (taille de particules 4µm). 3.3. Préparation des esters méthyliques des acides gras (voir méthode pour la détermination des esters méthyliques des acides gras par chromatographie gazeuse COI/T.20/Doc. Nº 33/ Rév. 1). 3.3.1. Méthanol ne contenant pas plus de 0,5% d’eau. 3.3.2. n-Heptane de qualité analytique. 3.3.3. Solution d’hydroxyde de potassium : solution méthanolique de 2 N : Dissoudre 1,1 g d’hydroxyde de potassium dans 10 mL de méthanol. 3.3.4. Éprouvettes de 5 mL de capacité à bouchon vissant muni d’un joint de PTFE. 3.4. Analyse des FAME par CG (voir méthode de détermination des esters méthyliques des acides gras par chromatographie gazeuse COI/T.20/Doc. nº 33 rev. 1). 3.4.1. Microseringues (5 µL) pour chromatographie en phase gazeuse, avec aiguilles. 3.4.2. Gaz vecteur : hydrogène ou hélium. 3.4.3. Hydrogène et air pour détecteur FID. 3.4.4. Gaz auxiliaire : nitrogène ou hélium. 3.4.5. Colonne capillaire en silice fondue (50-60 m x 0,25-0,30 mm de diamètre intérieur) recouverte de liquide cyanopropylpolysiloxane ou cyanopropylphenylsiloxane (SP-2380 ou équivalent) avec épaisseur de 0,20 à 0,25 µm. 4. MATÉRIEL 4.1. Appareil d’élution à vide pour extraction en phase solide. 4.2. Évaporateur rotatif. 4.3. Appareil de HPLC composé de : 4.3.1. Module pour le dégazage de la phase mobile. 4.3.2. Vanne d’injection Rheodyne ou injecteur automatique à boucle de 10 µL. 4.3.3. Pompe à haute pression. 4.3.4. Four thermostat pour colonne HPLC permettant de maintenir la température ambiante (15-20 ºC) (type Peltier par exemple). 4.3.5. Détecteur d’indice de réfraction. 4.3.6. Système informatisé d’acquisition des données muni d’un intégrateur. COI/ T.20/Doc. Nº 25/Rév. 2 page 3 4.4. Appareil de chromatographie en phase gazeuse sur colonne capillaire tel que décrit dans COI/T.20/Doc. Nº 33, équipé de : 4.4.1. Injecteur. 4.4.2. Détecteur à ionisation de flamme (FID). 4.4.3. Four avec température programmable. 4.4.4. Système informatisé d’acquisition des données muni d’un intégrateur. 4.5. Ordinateur équipé du logiciel Microsoft EXCEL. 5. Exécution de l’analyse 5.1. Purification de l’huile Placer une cartouche de silice SPE (3.1.3) dans un appareil d’élution à vide (4.1) et laver sous vide avec 6 ml d’hexane (3.1.4). Cesser d’appliquer le vide pour éviter que la colonne ne sèche et placer une fiole conique (3.1.1) sous la cartouche. Introduire une solution d’huile (environ 0,12 g) dans 0,5 ml d’hexane (3.1.4) dans la colonne. Introduire la solution puis éluer avec 10 mL du solvant (3.1.6) d’hexane-éther diéthylique (87:13 V/V) sous vide. Homogénéiser l’éluat et verser environ la moitié du volume dans une autre fiole conique (3.1.1). Faire évaporer les deux volumes séparément jusqu’à dessiccation dans un évaporateur rotatif (4.2) sous pression réduite et à température ambiante. Pour l’analyse des triacylglycérols, dissoudre l’un des résidus dans 1 mL d’acétone (3.1.8) (voir premier paragraphe de 5.2) et le verser dans une éprouvette de 5 mL à bouchon vissant. Dissoudre l’autre résidu dans 1 ml de n-heptane (3.1.7) et le verser dans une deuxième éprouvette de 5 ml à bouchon vissant pour préparer les esters méthyliques des acides gras. Note : La purification de l’huile peut être réalisée sur une colonne de gel de silice, comme décrit dans la méthode IUPAC 2.507. 5.2. Analyse des triacylglycérols par HPLC Régler le chromatogramme en maintenant la température de la colonne à 20 ºC et en utilisant du propionitrile (3.2.2) comme phase mobile à un débit de 0,6 mL/min. Lorsque la ligne de base est stable, effectuer une injection de solvant ; si la ligne de base présente une dérive dans la région de 12 à 25 min, utiliser un autre type d’acétone ou un mélange de propionitrile/acétone (25:75, V/V) pour dissoudre l’échantillon. Note : Certains types d’acétone produisent des dérives de la ligne de base dans la région mentionnée ci-dessus. Injecter 10 µL de la solution d’huile purifiée dans l’acétone (5%). Le processus dure environ 60 min. La température du four et/ou le débit doivent être ajustés de manière à obtenir un chromatogramme similaire à celui montré dans la Figure 1 où la trilinoléine (pic 1) élue à 15,5 min et jusqu’à ce que les résolutions entre les paires LLL/OLLn (pics 1 et 2) et OLL/OOLn (pics 4 et 5) soient bonnes. La hauteur du pic 2 (OLLn+PoLL) doit atteidre au moins 3% du fond de l’échelle. 5.3. Préparation des esters méthyliques des acides gras. Ajouter 0,1 mL de la solution méthanolique 2N d’hydroxyde de potassium dans la solution d’huile purifiée dans 1 mL de n-heptane. Boucher l’éprouvette à l’aide du bouchon et bien fermer. Agiter énergiquement pendant 15 s et laisser reposer jusqu’à ce que la partie supérieure devienne claire (5 min). La solution de n-heptane est prête pour l’injection dans la chromatographie. Il n’est pas recommander de stocker la solution à température ambiante pendant plus de 12 h. COI/ T.20/Doc. Nº 25/Rév. 2 page 4 5.4. Analyse des esters méthyliques des acides gras par chromatographie en phase gazeuse Suivre la procédure décrite dans la méthode de détermination des acides gras trans insaturés (COI/T.20/Doc. Nº 33). Le chromatographe est porté à une température de 165 ºC. Début isotherme à 165 ºC pendant 10 min, puis porter à 200 ºC à 1,5 ºC/min. Température de l’injecteur entre 220 ºC et 250 ºC recommandée pour minimiser la formation des acides gras trans (voir méthode COI). Température du détecteur : 250 ºC. Pression de la tête de colonne du gaz vecteur hydrogène ou hélium d’environ 130 kPa. Quantité de substance injectée 1µL en mode split. On doit obtenir un profil de CG similaire à celui montré dans la Figure 2. On accordera une attention particulière à la résolution entre C18:3 et C20:1 (le pic C18:3 doit apparaître avant le C20:1). Pour atteindre ces conditions, la température initiale et/ou la pression de la tête de la colonne doivent être optimisées. Ajuster les conditions de l’injecteur (température, split ratio et injection) de manière à minimiser la discrimination de l’acide palmitique et palmitoléique. La hauteur du pic C20:0 doit être d’environ 20% du fond de l’échelle pour quantifier les isomères trans. Si le pic C18:0 présente une distorsion, le volume de l’échantillon devra être réduit. 6. IDENTIFICATION DES PICS 6.1. Chromatogramme HPLC La Figure 1 montre un chromatogramme HPLC des triacylglycérols d’une huile d’olive purifiée. Tracer trois lignes de base : le premier entre le début du pic 1 et la fin du pic 3 ; le deuxième entre le début du pic 4 et la fin du pic 8 ; le troisième entre le creux précédant uploads/s3/ methode-coi-t-20-doc-25-rev-2-2018.pdf