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Revue des Maladies Respiratoires (2017) 34, 1124—1137 Disponible en ligne sur S

Revue des Maladies Respiratoires (2017) 34, 1124—1137 Disponible en ligne sur ScienceDirect www.sciencedirect.com SÉRIE « MOISISSURES INTÉRIEURES » Coordonnée par D. Charpin et D. Caillaud Méthodes d’identiﬁcation et de quantiﬁcation des moisissures de l’habitat : méthodes classiques, méthodes moléculaires Classical and molecular methods for identiﬁcation and quantiﬁcation of domestic moulds E. Fréallea,b,∗, V. Bexc, G. Rebouxd, S. Rousseld, S. Bretagnee,f a Université Lille, CNRS, Inserm, CHU de Lille, institut Pasteur de Lille, U1019 - UMR 8204 - CIIL -Center for Infection and Immunity of Lille, 59000 Lille, France b CHU Lille, Laboratoire de parasitologie-mycologie, 59000 Lille, France c Service parisien de santé environnementale, 75013 Paris, France d Chrono-environnement UMR 6249 CNRS, de parasitologie-mycologie, université de Bourgogne Franche-Comté, CHU de Besanc ¸on, 25000 Besanc ¸on, France e Laboratoire de parasitologie-mycologie, hôpital Saint-Louis, Assistance Publique—Hôpitaux de Paris (AP—HP) & Paris-Diderot, Sorbonne Paris Cité Université, 75010 Paris, France f CNRS URA3012, unité de mycologie moléculaire, centre national de référence des mycoses invasives et des antifongiques, institut Pasteur, 75015 Paris, France Rec ¸u le 8 octobre 2016 ; accepté le 9 janvier 2017 Disponible sur Internet le 15 novembre 2017 MOTS CLÉS Moisissure ; PCR quantitative ; Contamination intradomiciliaire ; Exposition aérienne ; Collecteur de poussières Résumé Introduction. — Pour appréhender les répercussions de l’inhalation constante et inévitable de spores de moisissures il est nécessaire de les prélever, les identiﬁer et les quantiﬁer. État des lieux. — Les prélèvements sont de trois types : (i) surfaces, de réalisation facile mais non quantiﬁables, (ii) air, faciles à calibrer mais limités dans le temps, et (iii) poussières, plus représentatifs dans le temps d’une exposition aux moisissures. La stratégie d’échantillonnage dépend des objectifs (exposition des personnes, objectiver la contamination, efﬁcacité de la remédiation). L’identiﬁcation des colonies obtenues en culture est réalisée par microscopie, Maldi-TOF , et/ou par séquenc ¸age ADN. ∗Auteur correspondant. Centre d’infection et d’immunité de Lille, institut Pasteur de Lille, 1, rue du Pr-Calmette, BP245, 59019 Lille, France Adresses e-mail : emilie.frealle-2@univ-lille2.fr, emilie.frealle@chru-lille.fr (E. Fréalle). https://doi.org/10.1016/j.rmr.2017.01.009 0761-8425/© 2017 SPLF . Publi´ e par Elsevier Masson SAS. Tous droits r´ eserv´ es. Mesure des moisissures de l’habitat 1125 Perspectives. — Les capteurs à poussières, faciles à mettre en œuvre et peu coûteux, repré- sentent une alternative pour la caractérisation qualitative et quantitative de la ﬂore fongique lors des enquêtes à domicile. Le comptage des colonies devrait être progressivement associé aux méthodes de PCR quantitative en temps réel dans l’attente de standardisation des méthodes de séquenc ¸age à haut débit. Conclusion. — La diversité des moisissures, du nombre de spores inhalées, et l’association à d’autres allergènes rendent l’évaluation des liens entre moisissures et impact sur la santé difﬁcile, d’où l’importance du développement d’outils quantitatifs faciles à mettre en œuvre. © 2017 SPLF . Publi´ e par Elsevier Masson SAS. Tous droits r´ eserv´ es. KEYWORDS Mould; Quantitative PCR; Household contamination; Environmental air exposure; Dust collector Summary Introduction. — To study the impact of the constant and inevitable inhalation of moulds, it is necessary to sample, identify and count the spores. Background. — Environmental sampling methods can be separated into three categories: surface sampling is easy to perform but non quantitative, air sampling is easy to calibrate but provides time limited information, and dust sampling which is more representative of long term exposure to moulds. The sampling strategy depends on the objectives (evaluation of the risk of exposure for individuals; quantiﬁcation of the household contamination; evaluation of the efﬁcacy of remediation). The mould colonies obtained in culture are identiﬁed using microscopy, Maldi-TOF , and/or DNA sequencing. Viewpoints. — Electrostatic dust collectors are an alternative to older methods for identifying and quantifying household mould spores. They are easy to use and relatively cheap. Colony counting should be progressively replaced by quantitative real-time PCR, which is already vali- dated, while waiting for more standardised high throughput sequencing methods for assessment of mould contamination without technical bias. Conclusion. — Despite some technical recommendations for obtaining reliable and comparable results, the huge diversity of environmental moulds, the variable quantity of spores inhaled and the association with other allergens (mites, plants) make the evaluation of their impact on human health difﬁcult. Hence there is a need for reliable and generally applicable quantitative methods. © 2017 SPLF . Published by Elsevier Masson SAS. All rights reserved. Qu’est-ce qu’une moisissure et pourquoi l’identiﬁer et la quantiﬁer ? Les moisissures sont des champignons ﬁlamenteux dont le biotope est le milieu extérieur. Ces champignons se développent sur de nombreux supports, principalement les végétaux en décomposition, et produisent des spores (souvent plusieurs millions/cm2), qui sont des formes de dis- sémination par l’air ou par l’eau. Ces spores de quelques micromètres de diamètre sont indispensables pour contami- ner de nouveaux milieux quand le premier est épuisé. Le contact avec ces spores et leur inhalation sont donc inéluc- tables et quotidiens [1]. Les conséquences médicales pour l’homme sont de deux ordres. Le risque infectieux est majeur en terme pronos- tique lorsque le patient développe une infection fongique invasive mais ces infections restent rares. En effet, le fait de réguler sa température à 37◦C permet à l’homme d’être résistant à l’immense majorité des champignons dont l’optimum thermique est la température ambiante [2]. Ainsi, de très rares moisissures parmi les millions d’espèces connues ou à décrire, sont responsables d’infections chez des patients profondément immunodéprimés (hémopathies malignes essentiellement) ou avec des pathologies préexis- tantes (caverne tuberculeuse, mucoviscidose par exemple) [3]. Il n’en est pas de même pour les pathologies allergiques qui sont extrêmement fréquentes et dans la physiopa- thologie desquelles les moisissures retiennent de plus en plus l’attention [4]. Nous ne parlerons pas ici des risques toxicologiques, bien que majeurs avec certaines espèces (aﬂatoxines et Aspergillus ﬂavus par exemple). Ces risques toxicologiques sont bien connus par voie alimentaire, beau- coup moins bien par voie respiratoire [5]. De même, nous n’aborderons pas les mesures indirectes des constituants fongiques exposées par ailleurs dans le cadre de cette série. Les problématiques de mesure et d’identiﬁcation vont donc être différentes selon que la question concerne le risque infectieux ou le risque allergique. Pour le risque infectieux, très peu d’espèces sont à surveiller (Aspergil- lus fumigatus principalement) et la quantiﬁcation apporte peu car on ne connaît pas le seuil minimal pour dévelop- per une infection. Pour l’allergie au sens large, le spectre des espèces est très vaste et la quantiﬁcation constitue un argument possible pour impliquer une espèce donnée. 1126 E. Fréalle et al. L’étude de l’habitat ou du lieu de travail peut aussi avoir un intérêt plus général pour caractériser un habitat avec un taux élevé de moisissures, déﬁni par une quantité supé- rieure à la normale. L’intérêt de la quantiﬁcation est alors majeur mais le dénombrement de toutes les espèces peut être secondaire et seules les plus fréquentes ou les plus faciles à mesurer peuvent sufﬁre pour l’état des lieux et le suivi de la remédiation. Ces espèces fréquentes et facilement mesurables peuvent être alors utilisées comme marqueurs de la contamination environnementale sans tirer de lien de causalité avec l’espèce mesurée et les symptômes observés. Les parts liées à l’humidité et aux moisissures sont alors difﬁciles à séparer, les moisissures se développant dans des milieux humides. Cependant, les spores peuvent persister sur les murs bien après la disparition d’une humidité accidentelle (inondations par exemple). Ces différents objectifs inﬂuent à l’évidence sur les stra- tégies d’échantillonnage, de collecte des prélèvements, d’identiﬁcation et de quantiﬁcation, qui sont extrêmement variables et peu standardisées, rendant les résultats obtenus même pour une méthode donnée difﬁcilement comparables entre les études. De plus, quand ces études mycologiques sont réalisées pour suivre des cohortes, il est souvent difﬁcile d’être homogène entre le début et la ﬁn de la surveillance en raison des développements technologiques successifs. • Les moisissures sont des champignons ﬁlamenteux qui se développent sur de nombreux supports extérieurs et se disséminent sous forme de spores par l’air ou par l’eau. • Les conséquences médicales pour l’homme sont de plusieurs ordres : allergiques, très fréquentes, toxiques, plus rares, connues surtout par voie alimentaire (aﬂatoxine par exemple), et infectieuses, rares et survenant chez des patients profondément immunodéprimés ou présentant des pathologies préexistantes (caverne tuberculeuse, mucoviscidose. . .). • Les stratégies de mesure et d’identiﬁcation diffèrent, selon que le risque est infectieux (faible nombre d’espèces, surtout Aspergillus, avec faible intérêt de la quantiﬁcation) ou allergique (grand éventail d’espèces et quantiﬁcation dans l’habitat ou le lieu de travail pouvant permettre de mettre en évidence l’implication d’une espèce donnée). • Ces différents objectifs expliquent la grande variété et la faible standardisation des stratégies d’échantillonnage, de collecte des prélèvements, d’identiﬁcation, et de quantiﬁcation, rendant difﬁciles les comparaisons entre les études ou le suivi de cohortes. Prélèvements Les prélèvements sont réalisés sous la responsabilité de per- sonnes formées, qui connaissent les limites des méthodes utilisées. Il peut s’agir de conseillers en environnement intérieur (CEI), conseillers habitat, techniciens des Agences régionales de santé (ARS) ou personnels de services communaux d’hygiène, de laboratoires de mycologie ou d’associations. Les prélèvements sont possibles au niveau : • des surfaces ou matériaux, décrits dans uploads/s3/ fralle2017-1.pdf