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GALERIE API 20E : ensemencement, lecture et interprétation 1- Présentation de l

GALERIE API 20E : ensemencement, lecture et interprétation 1- Présentation de la galerie Galerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de réaliser 23 tests biochimiques afin d’identifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE. Cupule La galerie API 20 E Microtube contenant le milieu déshydraté 1- GALERIE API 20E : son ensemencement 1- Présentation de la galerie Galerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de réaliser 23 tests biochimiques afin d’identifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE. Cupule La suspension bactérienne introduite dans le tube dissout les substrats déshydratés. La galerie API 20 E Microtube contenant le milieu déshydraté 2- Préparation de l’inoculum Prélèvement d’une souche pure sur GNI 1 seule colonie sur GO 5 mL d’eau distillée stérile isolement Souche pure sur GNI 5 mL d’eau distillée stérile Préparation de l’inoculum pour ensemencer la galerie API 20 E 3- Ensemencement de la galerie API 20 E Introduire la suspension bactérienne dans chaque tube à l’aide d’une pipette Pasteur stérile ouverte, pointe appuyée à l’intérieur et sur le côté pour éviter la formation de bulles Pour certains caractères: Remplir le tube de suspension puis Recouvrir d’huile de paraffine Pour les tests : ADH, LDC, ODC, H2S, URE Ensemencement de la galerie API 20E Remplir de suspension le tube et la cupule Pour les tests : CIT VP GEL 2- GALERIE API 20E : sa lecture 2-1- Les réactifs à ajouter pour la lecture 4- Lecture de la galerie API 20 E Après 24h d’incubation à 37°C, cupules ans lesquelles on doit rajouter des réactifs Napht-1-ol Naphtyl-1- amine Chlorure de fer III 2-2- Aspect des résultats positifs et négatifs 4- Lecture de la galerie API 20 E Les 10 premiers tests + Réactif TDA + Réactif Kovacs + Réactifs VP 1 et 2 + Réactif TDA + Réactif Kovacs + Réactifs VP 1 et 2 Tests négatifs Tests positifs après ajout des réactifs utiles Tests négatifs Tests positifs Après ajout des réactifs Nit 1 et Nit 2 : lecture de la NR (ici NR +) Les 10 derniers tests 2-3- Explication des résultats positifs ONPG Mise en évidence de la béta-galactosidase Substrat : ONPG Réaction : ONPG + eau Galactose + orthonitrophénol jaune ADH, LDC, ODC Mise en évidence de : - l'arginine désaminase - lysine décarboxylase - ornithine décarboxylase Substrats : - arginine (dans ADH), - lysine (dans LDC) - ornithine (dans ODC) Réactions : dégradations libérant des produits basiques Révélateur : rouge de phénol Rouge/Rose = + Jaune/Orangé = - Rouge/Orangé = + Jaune = - Citrate Mise en évidence de la dégradation du citrate comme seule source de carbone. Réaction : dégradation consommant des H+, donc responsable d’une alcalinisation. Substrat : citrate Révélateur : BBT Mise en évidence de production de sulfure Substrat : thiosulfate de sodium Révélateur : Fe3+ Résultat positif : présence d’un précipité noir de sulfure de fer H2S Mise en évidence de la présence d'une uréase Substrat : urée Réaction : urée + eau CO2 + 2 NH3, d’où alcalinisation. Révélateur : Rouge de phénol Lecture : attention un orange clair sera -, un orange foncé sera considéré comme + Urée Mise en évidence d'une tryptophane désaminase Substrat : Tryptophane Produit obtenu : Acide indol pyruvique Révélateur : - Réactif ajouté : Chlorure de fer III donnant un produit marron foncé en présence d’acide indol pyruvique TDA Indole Mise en évidence d'une tryptophanase Substrat : Tryptophane Produit : Indole Révélateur : - Réactif ajouté : Kovacs (ou James) Voges Proskauer Mise en évidence de la production d'acétoïne, de 2,3 butane diol et de butane dione Substrat : Pyruvate Révélateur : - Réactifs ajoutés : VP1 et VP2 (1- naphtol et KOH) TABLEAU DE LECTURE DE LA GALERIE MINIATURISÉE API 20E Microtube Substrat : Caractère recherché Révélateur Lecture directe ou indirecte Test (si nécessaire) Résultat - Résultat + ONPG ONPG = Ortho- Nitro-Phényl- Galactoside ADH LDC ODC Arginine Lysine Ornithine Rouge de phénol CIT Citrate H2S Thiosulfate de sodium Fe III URÉ Urée TDA Tryptophane IND Tryptophane VP Pyruvate de sodium GEL Gélatine Particules de charbon GLU à ARA = zymogramme Substrat carboné (glucide) NO2 - / N2 Nitrates (NO3 -) Béta galactosidase Lecture directe Arginine Dihydrolase Lysine Décarboxylase Ornithine Décarboxylase BBT Lecture directe Lecture directe Lecture directe Lecture directe Lecture directe Utilisation du citrate Production d’H2S Uréase Rouge de Phénol Tryptophane désaminase Tryptophanase ou production d’indole production d’acétoïne (3-hydroxybutanone gélatinase Utilisation de substrats carbonés (glucides) Nitrate réductase BBT Lecture directe Lecture indirecte Ajouter une goutte de réactif chlorure de fer III Lecture indirecte Ajouter une goutte de réactif Kovacs Lecture indirecte Ajouter 1 goutte de VP1 et VP2 Attendre 10 minutes Lecture indirecte Ajouter 1 goutte de NIT1 et NIT2 et zinc éventuellement BBT 3- GALERIE API 20E : son interprétation (identification de la souche) Validation et possibilité d’interprétation si : – Cupule Glu + – Ou 3 autres cupules au moins positives Démarche d’identification : - apporter la preuve que la bactérie appartient bien à la famille des Enterobacteriaceae (montrer qu’elle a les 7 caractères définissant la famille) - identifier le genre, voire l’espèce : * approche dichotomique, ou utilisation de tableaux des caractères * codage API * approche probabiliste utilisant un logiciel informatique 5 2 1 5 7 7 3 5 + + - Code n°: 5 215 773 (55) + + 5 5- Identification de la souche Se référer au catalogue pour identifier la souche à l’aide du code Lecture des résultats de la galerie : Résultats reportés sur la fiche d’identification 5- Identification de la souche (suite) Méthode d’identification probabiliste (p340 DTK) • Le nom du micro-organisme est obtenu par un calcul de probabilité • A chaque caractère d’un micro-organisme donné fait référence une probabilité d’être + ou – • La probabilité que ce soit un taxon donné correspond aux produits des probabilité attribué à chaque caractère (si + = % de positivité ou si - =100%-% de positivité) = Le logiciel classe tous les résultats pour donner le ou les taxons les plus probables. typicité Indice de typicité : comparaison entre le profil trouvé et le profil réel de la souche uploads/s3/ galerie-api-20e-ensemencement-lecture-et-interpretation 1 .pdf