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La réaction antigène - anticorps et ses applications 1. Généralités 1.1. Les an

La réaction antigène - anticorps et ses applications 1. Généralités 1.1. Les antigènes - antigène = toute substance capable de se lier spécifiquement à un anticorps ou TCR. - immunogène = substance qui provoque une réponse immunitaire spécifique quand elle est introduite dans un organisme - tous les immunogènes sont des antigènes mais pas l'inverse (ex : haptènes) - pour rendre un haptène immunogène, il faut le fixer sur une protéine porteuse. - épitope = structure reconnue, qui se lie au paratope de l'anticorps. Une protéine peut contenir plusieurs dizaines d'épitopes identiques, ou le plus souvent différents. Les épitopes peuvent être séquentiels (ils possèdent des AA à qui se suivent la structure primaire), ou conformationnel (les AA ne se suivent pas dans la structure primaire mais sont proches dans l'espace). 1.2. Les anticorps • isotypes = définissent les classes et sous classes : - IgG (1, II, III, IV) - Ig A (I, II) - Ig M, Ig D, Ig E - Ig kappa, Ig lamda • structure : différents domaines d'environ 110 AA. Les 2 chaînes L et H sont identiques 2 à 2. • domaines constants : propriétés effectrices de l'anticorps : - fixation du complément (IgG et Ig M) - cytophilie : un récepteur pour le fragment percé les IgG sur les cellules - passage transplacentaire (IgG : immunisation passive du nouveau-né) • paratope = structure qui se lie à l'épitope de l'antigène • sérum polyclonal (= sérum et humain =immum serum = anticorps polyclonal) : - c'est un sérum qui contient un mélange d'anticorps provenant de LB différents. - obtention : en injecte un antigène avec 3 épitopes à un lapin ; il produit 3 LB différents reconnaissant les 3 épitopes ; différenciation en 3 plasmocytes différents et donc sécrétion de 3 anticorps. Ces anticorps reconnaissent le même antigène mais avec des spécificités, des affinités différentes selon les épitopes ; ils peuvent aussi avoir des isotypes différents. • anticorps monoclonal : c'est un anticorps provenant d'un seule clone de LB stimulé - obtention : technique in-vitro d'hybridation lymphocytaire : immunisation d'une souris avec un antigène donc production de LB qui se différencient en plasmocytes. On récupère la rate de cette souris. On immortalise les cellules par fusion avec des cellules myélomateuses (cellule tumorale provenant de la moelle osseuse) = hybridomes. On sépare ces cellules. L'anticorps monoclonal produit est homogène : il est de même isotype, même allotype, même idiotype (spécificité). 2. aspect théorique de la réaction antigène - anticorps 2.1. Caractéristiques de la liaison antigène - anticorps - association de 2 molécules entre le paratope et l'épitope. Cette association nécessite une bonne complémentarité stérique entre les 2 sites réactifs. - c'est une réaction exothermique, spécifique et réversible. - la loi d'action de masse détermine la constance d'équilibre K = affinité intrinsèque. 2.2. Nature des liaisons - faible énergie - dépendent de la complémentarité entre le paratope et l'épitope - non covalentes • forces de van der Walls : - les plus faibles - dues au mouvement des électron dans la molécule : formation de dipôles SS • forces électrostatiques = liaisons ioniques : - entre 2 groupements ioniques - 2 à 5 kcal/mol • liaison hydrogène : - entre atomes électropositifs et électronégatifs - faibles • liaisons hydrophobes : - entre groupements polaires ou hydrophobes - faibles - il y a donc des forces d'attraction et de répulsion entre le paratope et l'épitope. L'énergie de liaison est élevée entre le paratope et l'épitope car toutes ces liaisons sont de faible énergie mais sont très nombreuses. - l'énergie dépend de la complémentarité entre les 2 sites. - quand on mesure l'affinité d'un anticorps pour son antigène, on mesure la somme des forces attractives et répulsives. 2.3. Mesure de l'affinité intrinsèque d'un anticorps • technique de dialyse à l'équilibre : - la différence de niveau à l'équilibre correspond à la quantité d'haptène liée à l'anticorps • à partir des données expérimentales on fait la représentation de Scatchard qui donne l'affinité de l'anticorps ainsi que sa valence (nombre de paratopes par molécule) - lorsque la moitié des sites d'anticorps sont liés à l'haptène : K = affinité = 1/[Ag]. - + la valeur de K est grande, plus l'anticorps est afin et plus il détecte de faibles concentrations d'haptène. 2.4. Avidité - K = mesure théorique de l'affinité intrinsèque d'un paratope pour l'épitope. - dans la réalité l'anticorps est au moins bivalent et les antigènes sont multivalents - l'interaction de l'anticorps avec l'antigène au niveau d'un seul site augmente la probabilité de rencontre au niveau du 2ème site - l'intensité des interactions = avidité = affinité fonctionnelle. - la somme théorique entre les affinités intrinsèques de chaque site est très inférieure à l'affinité réelle. - la multivalence augmente d'un facteur 10 puissance 3 pour 1 IgG et de 10 puissance 7 pour Ig M l'énergie de liaison pour un même épitope. Pour une affinité intrinsèque égale( 10 puissance 4) l'Ig M est + avide que l'IgG. - l'avidité conditionne la rapidité de formation d'un complexe antigène - anticorps. Elle dépend de l'affinité intrinsèque, de la valence de l'anticorps et de l'antigène, de conditions physicochimiques : température, pH, force ionique. - au cours d'immunisations répétées, l'affinité et l'avidité des anticorps augmentecar il y a une sélection des anticorps ayant des paratopes de plus en plus complémentaires des épitopes. 2.5. Spécificité et réactions croisées Cf. poly - les réactions croisées s'observent si 2 antigènes différents ont des épitopes communs, ou si l'un des anticorps du sérum immun se lie à un épitope ayant une structure chimique proche de l'épitope original 2.6. Applications des réactions antigène - anticorps 2.6.1. Diagnostic des maladies infectieuses (bactéries, virus, parasites, champignons) - diagnostic indirect = recherche d'anticorps spécifiques dans un sérum - diagnostic direct = recherche de l'agent infectieux dans différents liquides biologiques ou sur des biopsies. 2.6.2. Diagnostic de pathologies affectant le système immunitaire = déficit immunitaire, maladie auto-immunes (ex : polyarthrite rhumatoïde), hypersensibilité (= allergie), syndromes prolifératifs (ex : lymphomes) 2.6.3. Dosage quantitatif de molécules Hormones, vitamines, protéines inflammatoires, médicaments etc. que 3. Les réactions de précipitation 3.1. Généralités - c'est une réaction qui apparaît dans un milieu liquide ou gélifié entre un antigène soluble et 1 anticorps précipitant (Ig M, IgG). - le précipité est dû à la formation d'un réseau macromoléculaire tridimensionnel - l'anticorps doit être au moins bivalent (2 paratopes) : Fab ne donne pas de précipité ; seuls les sérums polyclonaux donnent des réactions de précipitation. - l'antigène doit être au moins bivalent (2 épitopes) : un haptène ne donne pas de réactions (un seul épitope) ; mais si l'haptène est couplé à une protéine porteuse, ça marche. 3.2. Précipitation en milieu liquide : méthode de Heidelberger et Kendall (1929) Cf. poly - C'est la première technique ayant permis de quantifier une réponse en anticorps - À partir de ces données expérimentales, on a déterminé une courbe de précipitation. Il en existe 2 types : • courbe de type lapin : 3 zones :  zone 1 : excès d'anticorps. Les complexes immuns sont de petite taille. Il existe des anticorps libre dans le surnageant.  zone 2 : zone d'équivalence. Tous les anticorps spécifiques sont complexés à l'antigène. Il n'existe pas d'anticorps libres ou d'antigènes libres dans le surnageant.  Zone 3 : zone d'excès d'antigène. La taille des complexes immuns diminue et le précipité se redissout. Il existe des antigènes libres dans le surnageant. • courbe de type cheval : 3 zones + une prézone = prozone. La prozone : dans les premiers tubes pas de précipité, car les anticorps ne sont pas précipitants. Cette prozone st due à des anticorps très affins qui ne précipitent pas. Il se forme des complexes immuns solubles. NB : la prozone est observable pour toutes les réactions antigène-anticorps. Il faut donc faire attention pour éviter les faux négatifs. 3.3. immunonéphélémétrie et immunoturbidimétrie - c'est une technique quantitative de dosage d'un Ag ou d'un Ac - un des réactifs est à concentration constante : antigène constant pour un dosage d'anticorps et inversement. - on obtient la concentration de la molécule à doser à partir d'une gamme d'étalonnage - technique utilisable pour des molécules à des concentrations du mg/l. Si la concentration d'anticorps correspond à celle d'antigène : apparition d'un trouble : - turbidimétrie : mesure du rayonnement absorbé - néphélémétrie : mesure du rayonnement diffusé (plus sensible). 3.4. Immuno-électrophorèse. - technique qualitative en 2 temps. - exemple : immuno-électrophorèse de protéines sériques • 1er temps : séparation des protéines sous l'action du champ électrique. Les protéines sont séparées selon leur charge et et leur PM • 2ème temps : révélation des protéines séparées par immuno-diffusion avec un sérum animal immunisé polyspécifique ou monospécifique. Cf. schéma poly. NB : application pour la recherche d'un déficit en anticorps. 4. Les réactions d'agglutination 4.1. Aspects théoriques - interaction entre un anticorps agglutinant spécifique (IgM, IgG) et un antigène particulaire. - on obtient des agglutinats visibles à l'oeil nu. - ex : hématies en milieu isotonique uploads/Finance/ la-reaction-antigene-anticorps 1 .pdf