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1 2éme année Option IAB/GE 2010/2011 M. Tavernier, Mme. Bonne Université du Lit

1 2éme année Option IAB/GE 2010/2011 M. Tavernier, Mme. Bonne Université du Littoral-Côte d'Opale IUT Calais-Boulogne Département Génie Biologique BP 120-62327 Boulogne/mer EXTRACTION DES LIPIDES TOTAUX ET TRYGLYCERIDES DE CHLORELLA VULGARIS TIERSOONE Laura DEBESQUE Julien BREFORT Alexandre DIEUSAERT Jonathan 2 Sommaire I. Introduction ................................................................................... 1 II. Synopsis .......................................................................................... 1 III. Matériels et protocoles ............................................................... 1 A. Préparation de la micro algue ............................................... 1 B. Extraction des triglycérides ................................................ 1 1. Soxhlet .................................................................................................. 1 2. Evaporation rotatif ............................................................................ 1 3. Saponification ...................................................................................... 1 C. Séparation des molécules ...................................................... 1 1. Chromatographie phage gaz ............................................................. 1 D. Détermination du pourcentage de triglycérides ............. 1 IV. Planning prévisionnel de la semaine d’expérimentation ........ 1 V. Matériel, produits, coût .............................................................. 1 VI. Bibliographie et réseau graphie ................................................ 1 3 Introduction Un projet de création d’un nouveau carburant, appelée le « bioéthanol » fus mis en place pour une durée de 5 ans pour espérer obtenir du biocarburant à partir de la micro algue Chlorella vulgaris. Chlorella vulgaris est une espèce d’algue verte unicellulaire microscopique depuis 2 milliards d’années. Grace à la photosynthèse, elle se reproduit très rapidement en eau tempérée dans des régions où l’ensoleillement est important et les températures assez douces. Une cellule mère se divise en 4 cellules fille de 16 à 20 heures. Avec un diamètre cellulaire d’environ 5micrometre, cette micro algues sphériques aux dimensions est comparable aux globules rouges. La Chlorella contient de grandes quantités de chlorophylles, d’acides aminés, d’acides nucléiques, d’enzymes, de lipides, de vitamines, de fibres et de minéraux. Les lipides synthétisés par Chlorella vulgaris (10 à 15 % de matière sèche) se composent de plus de 80 % d’acides gras insaturés avec en majorité l’acide alpha- linolénique, jusqu’as plus de 30 %. Dans un premier temps, il faut déterminer les conditions optimales de la culture en quantité de lumière, la quantité de CO2, ainsi que l’on ajuste la concentration en nitrates de potassium qui provoquera un stress et apporteras aller à la formation de lipides. Des que ses conditions optimales seront atteintes, on pourra alors commencer une extraction optimales. La détermination de la teneur en triglycérides peut être effectuée par différentes méthodes qui sont :  Extraction de Soxhlet : elle se fait en plusieurs cycles qui se répètent indéfiniment, elle permet de faire l’extraction par solvant continue d’une espèce chimique contenue dans une poudre solide. (dichloromethane−methanol extraction)  Méthode de Folch : consiste à transférer les acides gras de la micro algue dans une phase organique.  Extraction Goldfisch : (hexane extraction)  Hot extraction : même que soxhlet mais plus rapides 4 Après diverses recherches, les méthodes les plus utilisées sont soxhlet et la méthode de folch. Nous allons alors utilisée dans notre démarche la méthode de soxhlet pour alors extraire les lipides de notre micro algue. On passe notre échantillon obtenu après l’extraction à l’évaporation rotative pour éliminer l’hexane. Par la suite, pour vérifier si l’extraction se réalisa totalement, c’est-à-dire que notre échantillon ne contient que des triglycérides, on fait une analyse des acides gras par chromatographie en phase gazeuse après saponification des glycérides et conversion des savons en esters méthyliques volatils. Les résultats sont, par convention, exprimés en % des acides gras totaux. Ils peuvent aussi être exprimés en % de l’échantillon moyennant l’utilisation d’un étalonnage interne. Une quantification sera effectuée lorsque les rendements seront alors corrects. Notre projet se porte sur la détermination en triglycérides dans Chlorella vulgaris, d’où notre problématique : Extraction et détermination du taux des TAG parmi tous les lipides compris dans les micros algues. 5 Synopsis Centrifugation Elimination surnageant Séchage ou humidification de la micro algue Soxhlet sur micro algue séchée Solvant d'extraction: hexane Extraction Cyclohexane Saponification KOH/Ethanol Lavage à l'eau Chromatographie phase gazeuse 6 Mate riel et protocoles Ses manipulations devront se faire plusieurs fois pour confirmer les résultats avec plusieurs pesées différentes A. Préparation de la micro algue  Principe Chlorella vulgaris est une micro algue exigeante. Pour obtenir une teneur en lipide maximale de cette algue, elle doit être cultivée dans de meilleures conditions telles que le pH, la teneur en azote, la température … Doit être telle que la micro algue pousse la mieux. Le séchage de la micro algues est important car il faut éliminer tout l’eau contenu dans cette algue pour qu’elle ne se mélange pas avec l’hexane qui sera par la suite ajouté.  Matériel et réactifs  Etuve  Membrane humide  Solution mère de Chlorella vulgaris  Verrerie : pipette, bécher…  Eau distillée  Mode opératoire Dans un premier temps, il faut cultiver l’algue pour qu’elle donne une teneur en lipide maximal avec un rendement élevé. Et, pour finir, nous allons procéder à deux différentes méthodes :  Algues humides : séchage à l’étuve 105 °C 30 min puis à la température ambiante  Algues humides : filtration sur membrane humide puis séchage à température ambiante 1 nuit 7 B. Extraction des triglycérides 1. Soxhlet  Principe La méthode de soxhlet est la méthode la plus utilisée pour la détermination de la teneur en matières grasses. C’est une méthode gravimétrique, puisqu’on pèse l’échantillon au début et la matière grasse à la fin de l’extraction.  Matériel et réactifs  Extracteur Soxhlet  Cartouche de cellulose  Hexane (Gants et lunettes)  Pinces  Micro algues  Balance  Filtres  Mode opératoire On cherche dans un premier temps à extraire les lipides des micros algues. Il faut alors :  On pèse la masse de micro algues séchés ou humides  On ajoute ses micros algues à la cartouche de cellulose  On met la cartouche de cellulose dans l’extracteur de soxhlet, on l’as coince dans le contour métallique du support  On recouvre d’hexane la cartouche de cellulose  On effectue l’extraction suivant un programme définis  L’extraction est faite à chaud ou l’échantillon est immergé dans le solvant chaud et les matières grasses sont libérées de l’échantillon. Un équilibre se forme entre l’extrait en solution et celui à la surface de l’échantillon.  La cartouche est rincée par le solvant, évaporé et recondensé 8 Programmation de soxhlet : Programmation de soxhlet : Trempage : L’échantillon est immergé dans le solvant qui chauffe et les matières grasses sont extraites de l’échantillon vers le solvant en ébullition. Cette étape dure 40 min. Extraction : La cartouche est rincée par le solvant évaporée et recondensé. Cette étape dure 1heure. Récupération : La majeure partie du solvant est remontée dans la cartouche de cellulose. Les triglycérides sont alors dans la cartouche et les autres lipides sont aux font de la capsule. 9 2. Evaporation rotative  Principe L'évaporateur rotatif utilise une technique rapide et efficace de séparation : elle permet l'extraction d'un solvant dont la température d'ébullition est abaissée en travaillant sous pression réduite.  Matériel et réactifs  Evaporateur rotative  Solution d’hexane précédemment extrait contenant les lipides extraits  Tuyaux en caoutchouc  Ballon d’eau  Mode opératoire  Mettre l’échantillon dans le ballon  Ajouter de l’eau dans le chauffe-ballon  Chauffer à la température d’ébullition de l’hexane (69° C)  Faire aller la pompe à membrane pour fournir de la pression  Mis en marche de l’appareil  On récupère l’hexane dans le ballon de récupération  Pesée de la masse de lipides obtenus  Arrêt de l’appareil : o Casser le vide o Couper l’aspiration o Arrêter la rotation.  Reprendre les lipides dans 1mL d’hexane Extraction de solvants volatils qui peuvent être toxiques, travail sous Sorbonne Risque d'implosion car le système est sous pression réduite 10 3. Saponification  Principe La saponification est une méthode de séparation, aux cours de celle-ci les triglycérides sont hydrolysés en milieu alcalin par une base, généralement de la potasse (KOH) ou de la soude (NaOH), à une température comprise entre 80 °C et 100 °C. La température élevée sert à accélérer la réaction de saponification. Puis une méthylation est alors nécessaire pour méthylés les acides gras obtenus au parant qui pourront alors être passé à la CPG.  Matériel et réactifs  KOH  Bécher de 250mL  Soude  Méthanol   Bain-marie  Colonne à distiller  Mode opératoire 11 C. Séparation des molécules 1. Chromatographie phase gazeuse  Principe La chromatographie phase gazeuse est une technique qui permet d’identifier ou séparer les molécules d’un mélange. Le mélange à analyser est vaporisé à l'entrée d'une colonne, qui renferme une substance active solide ou liquide appelée phase stationnaire, puis il est transporté à travers celle-ci à l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les différentes molécules du mélange vont se séparer et sortir de la colonne les unes après les autres après un certain laps de temps qui est fonction de l'affinité de la phase stationnaire avec ces molécules.  Matériel et réactifs  Appareil de chromatographie en phase gazeuse, volume d'injection : 18 μL  Logiciel : chromcard  Micro pipettes  Tubes fermés hermétiquement en verre  Bombonne d'azote  Hexane  7% de tri-fluorure de bore dans le méthanol (BF3)  Méthanol  FAME uploads/Finance/ plugin-micro-algues-projet 2 .pdf