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1 PURIFICATION DES BIOMOLECULES EXEMPLE LES PROTEINE ELLE S sont toujours retro

1 PURIFICATION DES BIOMOLECULES EXEMPLE LES PROTEINE ELLE S sont toujours retrouvées en tant que composantes d’un mélange complexe incluant d’autres macromolécules biologiques; Alors que certaines protéines sont très abondantes (anticorps sanguins), d’autres ne sont rencontrés qu’en quantités très infimes (quelques molécules par cellule); La première étape dans l’étude de la structure/fonction d’une protéine sera donc toujours sa purification; À partir d’un échantillon biologique contenant la protéine d’intérêt, on effectue une série d’expériences effectuées séquentiellement qui permettront progressivement d’obtenir la protéine désirée sour forme « pure »; La purification d’une protéine est grandement facilitée si on connaît au départ: Les caractéristiques physico-chimiques générales de la protéine: Masse r,éelle pI, solubilité; Si une méthode expérimentale permet de détecter la présence de la protéine (réactifs, réaction enzymatique, effect physiologique, etc). 2 Techniques de purification des protéines 1.Isolement des protéines A. Choix d’une source de protéines B. Techniques de solubilisation C. Stabilisation des protéines D. Détection des protéines E. Stratégie générale de purification de protéines 2. Solubilité des protéines A. Influence de la concentration en sels B. Influence du pH 3. Separation par chromatographie A. Chromatographie par échange d’ions B. Chromatographie par filtration sur gel C. Chromatographie d’affinité D. Autres techniques chromatographiques 4. Electrophorèse A. SDS-PAGE B. Focalisation isoélectrique 5. Ultracentrifugation A. Ultracentrifugation préparative Purification des protéines Pourquoi purifier Etudier les propriétés d’une protéine Déterminer sa séquence en acides aminés Déterminer sa structure tridimensionnelle Utiliser une protéine (enzyme) dans un processus pour obtenir un produit pharmaceutique ou alimentaire Difficulté Les cellules contiennent généralement plus de 1000 types de protéines différentes. Chaque protéine a donc en moyenne une abondance inférieure à 1/1000 Solution Tirer profit des différences de propriétés physicochimiques et biochimiques des protéines: solubilité, taille, point isoélectrique, charge, hydrophobicité, affinité pour certains ligands22 Ces techniques sont des outils de base de la biochimie et beaucoup de ces techniques sont utilisées en routine pour des applications cliniques ou industrielles. 1 ISOLEMENT DES PROTEINES Certaines protéines représentent la substance principale d’une cellule, par exemple l’hémoglobine dans les globules rouges. D’autres protéines, comme le répresseur de l’opéron lactose d’E. coli, se trouvent qu’à raison de quelques molécules par cellule. Les mêmes techniques sont utilisées pour purifier ces deux protéines. Leur isolement et leur purification représentent souvent des jours de travail pour obtenir quelques milligramms (mg) ou microgramms (g) de la protéine désirée . A. Choix d’une source de protéines Les protéines qui assurent des fonctions identiques se retrouvent en général chez de nombreux organismes, par exemple les enzymes de la glycolyse Mais, on peut trouver différentes variantes d’une même protéine dans différents tissus du même organisme ou dans différents compartiments de la même cellule, par exemple des isozymes Le choix doit tenir compte de critères tels que: possibilité de se procurer facilement des quantités suffisantes du tissu d’ou on veut isoler la protéine On utilise souvent des tissus d’animaux tels que poulets, boeufs, porcs ou rats. On peut également partir de microorganismes comme E. coli ou la levure A. Choix d’une source de protéines.... Par clonage moléculaire, pratiquement n’importe quel gène codant une protéine peut être isolé de son organisme d’origine et exprimé en grande quantité (surexprimé) dans un organisme approprié mis en culture tel que E. coli ou la levure La protéine ainsi clonée et surexprimé peut représenter jusqu’à 30% des protéines totales de la cellule surproductrice Ceci facilite beaucoup l’isolement et la purification de la protéine clonée PURIFICATION DES PROTÉINES PROCÉDURE GÉNÉRALE 11 Homogénéisation Extrait protéique brut Étapes de purification grossières Chromatographie 1, 2, 3….x étapes PURE! (bon, bin, j’espère…) Détection de la présence de la protéine d’intérêt: - Activité - Pureté - Quantité 1. MÉTHODES GROSSIÈRES A-HOMOGÉNÉISATION La pré-purificatiion d’’agrégats protéiques d’’intérêt Les cultures de cellulaire et de levures recombinantes sont très souvent utilisées dans l’industrie biotechnologique afin de produire des protéines d’intérêt, notamment des enzymes. Ces protéines sont en général surexprimées et s’accumulent en grandes quantités à l’intérieur des cellules hôtes soit sous forme d’agrégats amorphes ou de corps d’inclusion, soit associées à des membranes ou localisées dans un compartiment cellulaire particulier. La pré-purification consiste à séparer le plus efficacement possible la protéine recherchée des débris cellulaires indésirables. La répartition de la protéine d’intérêt entre les fractions soluble et insoluble de l’homogénat dépend entre autres de la nature du tampon de broyage. L’efficacité des étapes constituant la pré-purification sera donc prépondérante pour le bon déroulement de toutes les étapes de purification qui suivront 12 Purification des protéines . 13 Objectifs • La caractérisation et l’optimalisation du broyage cellulaire de manière à faciliter les étapes de pré-purification qui suivent et augmenter leur efficacité, • L’étude de la solubilité de protéines d’intérêt dans l’homogénat cellulaire, • La mise au point d’une batterie de tests génériques pour identifier la composition optimale du tampon d’homogénéisation, • La prise en compte des aspects d’efficacité, robustesse, reproductibilité et transfert à l’échelle industrielle ont été considérés 14 Basées sur la solubilité de la protéine d’intérêt sous différentes conditions: pH Température Force ionique (i.e. concentration en sels); L’idée de base est d’utiliser des conditions expérimentales qui feront précipiter beaucoup de protéines de notre extrait brut, tout en laissant notre protéine d’intérêt en solution; Ce qui Permet de nous débarrasser d’une bonne partie des «cochonneries » présentes dans l’extrait brut; La solubilité des protéines est rendue possible par des interactions entre les chaînes latérales et le solvant: Si le solvant est l’eau: Liaisons hydrogène Interactions électrostatiques Si le solvant est non-polaire: Interactions hydrophobes; Ces interactions peuvent être modifiées en changeant la charge nette de la protéine, donc en modifiant le pH du solvant; De manière générale, les protéines précipitent lorsque le pH de la solution est égal au pI de la protéine: 15 2-précipitation différentielle 2.1. Précipitation par modification du pH pH solubilité pI La solubilité des protéines peut aussi être modifiée en altérant la concentration de sel dans l’extrait; Les sels ajoutés prendront la place de l’eau autour de la protéine; Les sels neutraliseront les charges des chaînes latérales de la protéine; Ces deux évènements favoriseront l’aggrégation et la précipitation des protéines; Généralement, le « salting out » est fait par l’ajout de sulfate d’ammonium: (NH4)2SO4 Plus soluble dans l’eau que le NaCl; Requiert une quantité moins grande que le NaCl pour précipiter les protéines. Une protéine donné précipitera généralement lorsqu’une concentration spécifique de (NH4)2SO4 est atteinte; Ceci permet de nettoyer notre extrait brut de manière séquentielle; Les protéines précipitées sont alors jetées à la poubelle, ou sujettes à la dialyse (pour enlever le sel de l’échantillon); 16 2-PRÉCIPITATION DIFFÉRENTIELLE 1.2 «SALTING OUT » 17 PRÉCIPITATION DIFFÉRENTIELLE 1.2.SALTING OUT PRECIPITATION!! Centrifugation: Séparation selon la densité; Les molécules denses (i.e. grosses) vont sédimenter (former un culot) plus vite que les molécules moins denses (i.e. plus petites); 18 PRÉCIPITATION DIFFÉRENTIELLE 1.2.SALTING OUT Mélange de protéines dans un tampon: A: précipite à [ ] sel = 15% B: précipite à [ ] sel = 25 % C: précipite à [ ] sel = 35% 1) Ajoute (lentement) (NH4)2SO4 à 20% 2) Centrifuge pour récupérer les protéines précipitées Culot: protéine A Surnageant: protéines B + C 1) Ajoute (lentement) (NH4)2SO4 à 30% 2) Centrifuge pour récupérer les protéines précipitées Culot: protéine B Surnageant: protéine C CENTRIFUGATION Technique très utilisée permettant de séparer des substance via l’application d’une force centrifuge; L’intensité de la force centrifuge devant être appliquée varie selon la nature de la substance à séparer: 500 x g pour cellules entières 15 000 x g pour les mitochondries 150 000 x g pour les ribosomes Note: 1 x g = force gravitationnelle terrestre au niveau de la mer (~ 9.8 m/s2) Les substances particulaires vont atteindre le fond du tube (i.e., elles forment un culot) Le liquide résiduel est appelé le surnageant. Peut aussi être utilisé pour séparer des substances particulaires de densité différente (les substances plus denses sédimenteront plus rapidement que celles qui sont moins denses. e.g. séparation des érythrocytes et leucocytes 19 Parce que le sel ajouté pour le « salting out » inhibe l’activité des protéines, il doit être enlevé avant de continuer la purification; Ceci est fait par dialyse; La solution de protéine est simplement introduite dans un sac fabriqué d’une membrane semi-perméable: Perméable aux petites molécules (e.g. sels); Imperméable aux protéines; Permet aussi de changer de tampon avant de procéder à l’étape suivante. 20 DIALYSE Heures Après avoir utilisé des méthodes grossières afin de concentrer notre protéine favorite, on utilise des méthodes plus raffinées afin de purifier notre protéine le plus possible; Ceci est fait généralement en utilisant différents types de chromatographie: Échange d’ions; Tamisage moléculaire; Affinité Ceci est fait généralement en utilisant la Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC). 21 PURIFICATION DES PROTÉINES 2. MÉTHODES FINES Colonne Collecteur de fractions Réservoir de tampon Pompes Injecteur (échantillon) Permet de séparer les protéines selon leur charge Le mélange de protéines est placé dans un tampon dont le pH permet à notre protéine d’avoir une charge précise; Le mélange est ensuite déposé sur la colonne de séparation; Échange de cations: Phosphocellulose Carboxyméthyl (CM) cellulose Échange d’anions: Diéthylaminoéthyl (DEAE) cellulose C H uploads/Finance/ purification-des-proteines.pdf