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Exercice 1 : L'une des étapes de purification des protéines est la précipitatio

Exercice 1 : L'une des étapes de purification des protéines est la précipitation fractionnée par addition d'un sel dans la solution protéique. L’addition du sel se traduit par une augmentation du volume de la solution. La grandeur qui tient compte de cette augmentation est le volume spécifique (c’est l’inverse de la densité). A. Définir la méthode de précipitation fractionnée. Donner un exemple de son application. B. Calculez la concentration molaire d’une solution saturée de (NH4)2SO4 à 0°C. C. Calculez, à 0°C, la quantité de NH4)2SO4 solide à ajouter à 500 mL d’une solution à 40 % de saturation pour l’amener à 60 % de saturation. Correction : A- La précipitation fractionnée est une précipitation douce qui permet de préserver l’intégrité fonctionnelle de la protéine d’intérêt, elle se fait par l’ajout progressif du sel afin d’isoler la protéine d’intérêt dans une des fractionnes récupérées. Le sulfate d’ammonium est largement utilisé dans cette méthode. (voir le chapitre 2). Exemple de son application : purification des enzymes (cellulases, laccases, lipases…) B- La dissolution d'un soluté correspond à la formation de liaisons hydrogène entre les groupements polaires ou chargés du soluté et les molécules d'eau. En solution, l'anion SO42-et le cation NH4+sont donc entourés d'une enveloppe d'hydratation et occupent un volume plus important que sous la forme de sel (cristal). Cette augmentation de volume est traduite par le volume spécifique. Université Cadi Ayyad Faculté Polydisciplinaire de Safi Semestre : SVI-S3 Module : Techniques chimiques pour la biologie TD N°2 (Exercices corrigés) Exercice 2 : Un extrait contenant une enzyme E a été fractionné selon des concentrations croissantes de sulfate d'ammonium en vue de mettre au point une méthode de purification par précipitation. -A l'aide de tableau (ci-dessous), retrouver la concentration en sel de chaque étape en fonction de la quantité ajoutée. On part de 500 cm3de solution. Après décantation de chaque fraction, l’estimation des protéines totales a été effectuée pour la partie soluble. Parallèlement, un prélèvement de 0,1 cm3 de cette fraction soluble a permis de déterminer l'activité de l'enzyme Correction : Exercice 3 : Une chromatographie d’un mélange réactionnel a été effectuée sur couche mince. Après avoir tracé une ligne de dépôts à 2 cm du bord inférieure de la plaque et déposé un échantillon grâce à un capillaire et après une heure d’élution dans un bécher couvert par un verre de montre et contenant l’éluant, ce dernier a présenté un front de migration à 9 cm de la ligne de dépôt. La révélation a été réalisée sous UV et a montré 3 taches a, b et c, distantes de la ligne de dépôt de respectivement 2, 5 et 7 cm. 1) Faire un schéma du montage chromatographique sachant que le bord inférieur de la plaque touche le fond du bécher. 2) Quel doit être la hauteur maximale de l’éluant dans le bécher et pourquoi ? 3) Positionner sur la plaque rectangulaire de 3 x 10 cm, le niveau du front de migration et les taches obtenues après révélation et calculer leurs Rf. 4) Classer les produits a, b et c par ordre de polarité croissante. 5) Pour permettre au produit a de migrer plus loin, a-t-on intérêt à utiliser un solvant de polarité supérieure ou inférieure au 1er éluant utilisé ? justifier votre réponse. 6) La tache b est soupçonnée contenir plus d’un produit. Comment pourrait-on séparer ce mélange ? Correction : 2) La hauteur maximale de l’éluant dans le bécher doit être inférieure à 2 cm pour qu’il ne touche pas l’échantillon déposé. Rf = Hauteur de migration du soluté / Hauteur du front de migration Rf (a) = 2/9 = 0,22 ; Rf (b) = 5/9 = 0,55 ; Rf (c) = 7/9 = 0,77 4) Classement par ordre de polarité croissante : c < b < a (Plus un composé est polaire, plus il s’accroche au support, moins il migre avec l’éluant). 5) La polarité du solvant doit être supérieure à celle de l’éluant ; le solvant polaire va mieux attirer le soluté et permettre son décrochage du support et sa migration rapide vers le haut. 6) Pour dévoiler la composition exacte de la tache b, on peut procéder par une chromatographie de la seconde dimension (chromatographie bidimensionnelle). Exercice 4 : Correction : uploads/Finance/ td2-corrige 6 .pdf