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DEPARTEMENT DE BIOTECHNOLOGIE Thèse présentée en vue de l’obtention du diplôme

DEPARTEMENT DE BIOTECHNOLOGIE Thèse présentée en vue de l’obtention du diplôme de Doctorat en Science Option : Microbiologie Par Mme GUERMOUCHE M’RASSI Amel Sujet de thèse : Caractérisation moléculaire des bactéries impliquées dans la biodégradation des hydrocarbures Devant le jury composé de : Président Pr ABI AYAD Sidi Mohammed El-Amine Université d’Oran (Es-Sénia) Promoteur Pr BENSALAH Farid Université d’Oran (Es-Sénia) Examinateur Pr MESLI TALEB BENDIAB Farida Université d’Oran (Es-Sénia) Examinateur Pr SLIMANI Miloud Université de Saida Examinateur Pr ABDELOUAHID Djamel Eddine Université de Tlemcen Examinateur Pr BENYAHIA Mohamed Université de Sidi Belabbes Invité Mr RAIS Ali Abdelhamid Directeur Raffinerie Arzew- Oran- Sonatrach 2013-2014 REMERCIEMENTS Merci au bon Dieu de m’avoir aidé à réaliser cet ouvrage. J’exprime ma gratitude aux membres du jury pour avoir accepté d’examiner ce travail ainsi que pour la discussion apportée sur ce projet. Je témoigne mes plus vifs remerciements au Pr Abi Ayad Sidi Mohammed El-Amine qui a bien voulu présider le jury de ce Doctorat, au Pr Mesli Taleb Bendiab Farida, au Pr Benyahya Mohamed, au Pr Abdelouahid Djamel Eddine et au Pr Slimani Miloud qui nous ont honoré de leur présence et pour avoir accepté de juger ce travail. Par ailleurs, j’adresse mes sincères salutations à Mr Rais Ali abdelhamid Directeur de la raffinerie d’Arzew-Oran d’avoir accepté notre invitation. Un projet de thèse ne se réalise jamais seul, c’est pourquoi je souhaiterai ici remercier toutes les personnes qui ont participé à des années d’aventure scientifique et humaine. Je souhaiterai tout d’abord exprimer mes remerciements au professeur Bensalah Farid, directeur du Laboratoire de Génétique Microbienne (LGM) à l’Université d’Oran- Es-Sénia, pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire et permis de réaliser une partie de cette thèse dans de bonnes conditions. Je lui dis merci également pour m’avoir fait profiter de ses connaissances scientifiques, pour toute l'aide qu'il m'a apporté sur mes travaux, pour ses encouragements durant ces années au sein de l’équipe. Je voudrai dire un grand merci au Pr Robert Duran et au Dr Jérôme Gury du Laboratoire de l’Environnement Ecologie Microbienne (EEM) de l’Université de Pau et des Pays de l’Adour en France pour leur accueil et leur collaboration, pour les connaissances qu’ils m’ont fait partager durant 18 mois de travail. Merci à Jérôme pour l’aide précieuse en biologie moléculaire et pour les discussions enrichissantes que nous avons eu sur le projet. Cela m’a permis d’explorer les données selon de nouvelles perspectives et de développer mon esprit critique sur les méthodes moléculaires que nous utilisons. Merci à tous les membres de l’équipe LGM et EEM pour m’avoir donné un environnement de travail agréable grâce à leur présence, leur bonne humeur et leur soutien. Un merci particulier à Neil Gray du Laboratoire de l’École de génie civil et de géosciences de l'Université de Newcastle en Angleterre, qui m’a accueillie dans son laboratoire afin de travailler sur les analyses TLC/FID, pour sa gentillesse, son aide scientifique, et sa disponibilité. Pour terminer, je souhaiterai remercier ma famille et mes amis pour leur soutien non seulement tout au long de la thèse mais aussi depuis de nombreuses années. Merci pour leur présence, leur aide, leur compréhension et leur amour. Merci aussi à mon mari, pour son soutien et son amour indéfectible. Je leur dédie cette thèse. Enfin, je tiens à remercier le Groupe de la plateforme SONATRACH, de nous avoir ouvert les portes pour entamer ce travail avec les échantillons de sol contaminé, sans qui cette thèse aurait été encore plus difficile. Merci a tous. Résumé Les produits pétroliers, du fait de leur utilisation massive, constituent des polluants importants des aquifères et des sols. Le devenir de ces polluants rejetés dans l’environnement est principalement gouverné par les processus de biodégradation. L’existence de ces phénomènes dépend de la biodégradabilité intrinsèque du polluant mais aussi de la présence de microflores dégradatrices compétentes dans les eaux souterraines et dans les sols. Au cours de ce travail, nous avons développé une méthodologie permettant d’évaluer la biodégradabilité des hydrocarbures pétroliers en conditions aérobies. Elle consiste à mesurer, par méthodes analytiques telles: Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) et Chromatographie sur Couche Mince (CCM) couplées à un Détecteur à Flamme d’Ionisation (FID), après incubation dans des conditions optimales, la consommation de chacun des hydrocarbures présents dans différentes fractions du pétrole (saturés et aromatiques). En utilisant une méthode de séquençage des gènes codant l’ADNr 16S, les compositions en micro-organismes des bactéries adaptées au sol contaminé par les hydrocarbures ont été déterminées. Des arbres phylogénétiques ont été élaborés. Les capacités de dégradation des bactéries sélectionnées et la présence ou non de gènes fonctionnels de dégradation codant pour l’oxydation initiale des hydrocarbures (alkB, nahAc, nidA) ont été étudiées. Les résultats indiquent que le groupe Gamma-Protéobactéries était le principal acteur de cette dégradation. Pseudomonas sp. groupe bactérien majoritaire spécifique adapté à la pollution aux hydrocarbures à la capacité de métaboliser (en culture simple) certains hydrocarbures récalcitrants (alcanes ramifiés tel le Pristane (n-C19) à 35.11% et les aromatiques lourds tels le Benzo[a]Pyrène (n-C20) à 33.93% et de cométaboliser (en consortium) les différentes fractions du pétrole brut à 50.44% pour les saturés et à 30.42% pour les aromatiques polycycliques. L’efficacité de la biodégradation des microflores est liée à la présence de voies métaboliques particulières chez certains micro-organismes et à la coopération entre les différents micro-organismes composant les microflores. Ces bactéries hydrocarbonoclastes peuvent être utilisées pour concevoir des cultures mixtes (consortium) avec des capacités de biodégradation spécifiques pour les différentes fractions pétrolières dans les traitements des stations d’épuration. Mots-clés : bioremédiation, hydrocarbures pétroliers, Pseudomonas, HAP, alcanes, ADNr16S, biomarqueurs alkB;nahAc; nidA, consortium. Abstract Because of their massive utilization, hydrocarbons are major pollutants of soils and aquifers. Biodegradation is a key aspect of the fate of pollutants in the environment. Such knowledge concerns in particular the intrinsic biodegradability of the products and the distribution in the environment of competent degradative microflorae. In this study, a methodology has been developed to assess the aerobic biodegradability of petroleum hydrocarbons. It is based on the Gas Chromatographic and Thin Layer Chromatography (TLC) coupled with a Flame Ionization Detector (FID) analysis of hydrocarbons, after incubation in optimal conditions of major compounds in crude oil (saturates and aromatics fractions). Using a method of gene sequencing 16S rDNA, the identification of bacteria adapted to soil was determined. Based on nearly full length 16S rRNA gene sequencing analysis, a phylogenetic trees was constructed. Capacity of degradation of selected bacteria and the presence or absence of functional genes coding for the initial oxidation of hydrocarbons (alkB, nahAc, nidA) were studied. The results indicate that the Gamma-Proteobacteria group was the main actor of this degradation. Pseudomonas sp, specific bacterial group suitable for petroleum hydrocarbon pollution has the ability to metabolize (single culture) a high mass residues, Pristane (n-C19) at 35.11% and Benzo[a]Pyrene (n-C20) at 33.93% and co-metabolize (in consortium) fractions in petroleum-hydrocarbon, 50.44% of saturates and 30.42% of aromatics compounds. Biodegradation efficiency of soil microflorae depended on the specific metabolic pathways of some microorganisms and on the cooperation within microbial population. This study provides a better understanding of the adaptation of bacteria inhabiting polluted environments and for developing and implanting adequate bio-strategies in the future to enhance oil in contaminated soil and the biotreatment of oily waste water in refineries. Keywords: bioremediation, petroleum hydrocarbons, Pseudomonas, PAH, alkanes, DNAr16S, biomarqueurs alkB, nahAc, nidA, consortium. ملخص انًؼبندت انحٕٛٚت نهًحزٔلبث انُفطٛت فٙ انخزبت انًهٕثت ببنُفط ػٍ طزٚك بكخٛزٚب يحهٛت حزابٛت: حؼٍٛٛ ٔ حؼزٚف حزكٛب انكبئُبث انذلٛمت انًخخصصت فٙ ححهٛم انًٕاد انُفطٛت ػٍ طزٚك انبٕٛنٕخٛب اندشٚئٛت( ػًهٛبث حضخٛى خُٛبث يخخصصت ُٕ٘ٔنهحًض ان( ADN ) ػٍ طزٚك سهسهت حفبػم انبٕنًٛٛزاس (Polymérase Chain Réaction) نكثزة إَخبج ٔاسخخذاو انًحزٔلبث انُفطٛت ػهٗ َطبق ٔاسغ فٓٙ حؼخبزيٍ انًهٕثبث انزئٛسٛت فٙ انخزبت ٔ انًٛبِ اندٕفٛت . ٙٚخضغ أسبسب يصٛز ْذِ انًهٕثبث فٙ انبٛئت نؼًهٛت انخحهم انبٕٛنٕخ . ٕ٘ٛٔخٕد ْذِ انظبْزة ٚؼخًذ ػهٗ انخحهم انح انًخخص ببنًهٕثبث ٔ نكٍ أٚضب بٕخٕد كبئُبث دلٛمت فؼبنت فٙ انخزبت ٔ انًٛبِ اندٕفٛت . فٙ ْذا انؼًم لًُب بخطبٛك يُٓدٛت نخمٛٛى لببهٛت انبكخٛزٚب ػهٗ انًؼبندت انبٕٛنٕخٛت نهًحزٔلبث انبخزٔكًٛٛبئٛت بٕخٕد ٍٛاألكسد (O2) انخٙ ححث ػهٗ انمٛبص يٍ خالل أسبنٛب ححهٛهٛت يثم: كزٔيبحٕغزافٛب بٕخٕد انغبس(CPG) ٔكزٔيبحٕغزافٛب ػٍ طزٚك انطبمت انزلٛمت(TLC) انًؼخًذحٍٛ ػهٗ ٔخٕد كبشف انخأٍٚ ببنهٓب(FID) . بؼذ يزٔر فخزة انحضبَت ٔ ححج ظزٔف يٓٛئت ٚخى ححهٛم انًٕاد انُفطٛت انًٕخٕدة ٔانًشكهت نألخشاء انزئٛسٛت انًكَٕت نهبخزٔل انخبو (انًشبؼت ٔ انؼطزٚت) . ٗببسخخذاو طزٚمت انخسهسم اندُٛٙ انذ٘ ٚحث ػه ADNr 16S حى حؼٍٛٛ ٔ حؼزٚف حزكٛب انكبئُبث انحٛت انذلٛمت انًخخبرة ٔ انًٕخٕدة فٙ انخزبت . ٍحًج دراست لذرة ٔ إيكبَٛبث انبكخٛزٚب انًخخبرة ػهٗ ححهٛم انًهٕثبث انبٛخزٔكًٛبئٛت ٔ انبحث ػ اندُٛبث ٔظٛفٛت انخزيٛش ٔ انًخخصت فٙ األكسذة األٔنٗ نهًٕاد انُفطٛتalkB, nahAc, nidA) ( ػُذ انبكخٛزٚب انًحصهت ػهٛٓب . حشٛز انُخبئح إنٗ أٌ يدًٕػتGamma-Protéobactéries ٙ ْٙ انًًثم انزئٛسٙ نٓذا انخحهٛم انبٕٛنٕخ . انُٕع Pseudomonas يخخصص فٙ حفكٛك انًهٕثبث انُفطٛت ٔ نّ انمذرة نخحهٛم انًهٕثبث نٕحذِ يثم انًكَٕبث انًشبؼت انثمٛهت: Pristane ( n-C19 ) ٙبحٕان35.11 % ٔ انًكَٕبث انؼطزٚت: Benzo [a] Pyrène ( n-C20 ) ٙبحٕان 33.93 % ّٔن ٙانمذرة ػهٗ ححهٛم انبخزٔل ببالسخؼبَت ٔانخزبٛت يغ أحٛبء دلٛمت أخزٖ بحٕان50.44 % ٙنهًكَٕبث انًشبؼت ٔ بحٕان 30.42 %نهًكَٕبث انؼطزٚت . ٍٛحزحبط فؼبنٛت انخحهم انبٕٛنٕخٙ uploads/Geographie/ 14201408t-pdf.pdf