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BIO303 Rédigé par Chringel Page | 1 Les Milieux de Culture en Bactériologie Les

BIO303 Rédigé par Chringel Page | 1 Les Milieux de Culture en Bactériologie Les Milieux de Culture Gélose au Cétrimide - milieu sélectif Composition  Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptone  Glucide et dérivés : /  Autres molécules carbonées : /  Indicateurs S2- : /  Inhibiteurs : cétrimide (antiseptique), acide nalidixique  Divers : /  Indicateurs de pH : /  Ions minéraux : chlorure de magnésium MgCl2, sulfate de potassium K2PO4, hydrogénophosphate de potassium  Agar : oui  Eau : oui Caractéristiques  Milieu proche du King A, favorise la production de pyocyanide.  Milieu relativement pauvre.  Acide nalixidique : inhibiteur des Gram –  Cétrimide : inhibiteur des Grams + donc des Gram – par extension.  Ensemencement en cadran. Usage  Recherche des Pseudomonas, notamment Pseudomonas earuginosa. Lecture  Incubation 24h à 37°C : Développement Pseudomonas aeruginosa et éventuellement Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri et Pseudomonas maltophilia.  Incubation 24h à 42°C : Développement presque exclusif de Pseudomonas aeruginosa.  Pyocyanine : milieu bleu  Pyoverdine : milieu jaune-vert  indicateur de la présence de Pseudomonas BIO303 Rédigé par Chringel Page | 2 Gélose de Chapman – milieu sélectif Composition  Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : Peptones, extrait de viande  Glucides et dérivés : /  Autres molécules carbonées : mannitol  Indicateur S2- : /  Inhibiteurs : NaCl à 75g/L  Divers : /  Indicateurs de pH : rouge de phénol  Ions minéraux : NaCl  Agar : oui  Eau : oui Caractéristiques  Permet la croissance des bactéries halophiles.  Très forte concentration en NaCl permettant l’inhibition des Gram-  Permet l’étude de l’attaque du mannitol (si baisse du pH, alors teinte jaune)  Ensemencer richement en stries ou cadran.  Incubation : 24-48h Usage  Isolement de Staphylococcus aureus.  Numération des staphylocoques. Lecture  Si Staphylococcus aureus : colonie jaunes avec halo clair. Mannitol + Les autres colonies sont Mannitol -. Contamination possible par Enterococcus et certains Bacillus. BIO303 Rédigé par Chringel Page | 3 Drigalski – milieu sélectif Composition  Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : Peptones, extraits de viande et levure  Glucide et dérivés : Lactose  Autres molécules carbonées : /  Indicateurs S2- : /  Inhibiteurs : Cristal violet, Désoxycholate de sodium  Divers : /  Indicateurs de pH : Bleu de Bromothymol  Ions minéraux : Thiosulfate de sodium  Agar : oui  Eau : oui Caractéristiques  Cristal violet : inhibe les bactéries Gram +  Désoxycholate de sodium : inhibe les bactéries Gram +  Sélectionne les bactéries Gram –  Inoculation en cadran. Usage  Isolement des entérobactéries. Lecture  Bactéries lactose + : colonies jaunes (utilisation du lactose)  Bactéries lactose - : colonies bleu-vert Lexique Mannitol : utilisé pour étudier sa voie d’attaque par les bactéries (fermentation…). Bleu de Bromothymol : vert (basique) et jaune (acide) Entérobactéries : bactéries se trouvant dans les cavités internes des êtres vivants comme l’appareil digestif. Rouge de phénol : rouge (basique) à jaune (acide) BIO303 Rédigé par Chringel Page | 4 Hektoen – milieu sélectif Composition  Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : Peptones, extraits de levure  Glucide et dérivés : salicine, lactose, saccharose  Autres molécules carbonées : /  Indicateurs S2- : citrate de fer  Inhibiteurs : sels biliaires  Divers : /  Indicateurs de pH : Bleu de bromothymol, fuschine acide  Ions minéraux : Thiosulfate de sodium, NaCl  Agar : oui  Eau : oui Caractéristiques  Sels biliaires : limitent le développement des Gram +  Fuschine : vire au rose s’il y a production d’aldéhyde.  Favorise Salmonelle et Shigella du fait des peptones.  Mise en évidence de la production d’H2S Usage  Isolement des entérobactéries pathogènes : principalement pour vérifier la présence de Shigella et Salmonella. Lecture  Aspect des colonies : H2S Attaque glucide Production aldéhyde Saumon - + + Saumon et centre noir + + + Bleu-vert - - - Bleu-vert et centre noir + - -  Interprétation : o Saumon : Escherichia, Levinea, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Yersinia. o Saumon et centre noir : Proteus vulgaris. o Bleu-vert : suspicion de Shigella ou Salmonella. o Bleu-vert et centre noir : suspicion de Salmonella. BIO303 Rédigé par Chringel Page | 5 Hugh et Leifson – milieu différentiel Composition  Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptones, extrait de levures  Glucide et dérivés : glucose  Autres molécules carbonées : /  Indicateurs S2- : /  Inhibiteurs : /  Divers : /  Indicateurs de pH : bleu de bromothymol  Ions minéraux : NaCl, K2HPO4  Agar : oui  Eau : oui Usage  Détermination de la voie d’attaque des Glucides, utilisés comme principale source d’énergie par les bactéries. L’utilisation du glucose acidifie le milieu, le BBT va alors virer au jaune. Technique  Régénérer les 2 tubes : création gradient d’oxygène.  Les ramener à 45°C.  Ajouter aseptiquement quelques gouttes d’une solution de glucose stérile. Concentration finale dans le tube environ 10g/L.  Agiter le tout pour répartir le glucose dans tout le tube.  Solidifier les deux tubes en les plongeant dans l’eau froide.  Ensemencer chaque tube par piqûre centrale avec la pipette Pasteur.  Recouvrir l’un des deux tubes de paraffine ou vaseline stérile.  Incubation 24h à 37°C. Tube recouvert = tube fermé Tube non recouvert = tube ouvert NE PAS REVISSER A FOND LES BOUCHONS. Lecture Il peut y avoir formation de gaz par les bactéries. Résultats après cultures 24h à 37°C Interprétation Le glucose est dégradé en aérobiose et en anaérobiose : bactérie fermentative du glucose. BIO303 Rédigé par Chringel Page | 6 Le glucose est dégradé en anaérobiose uniquement : bactérie fermentative du glucose. Utilisation du glucose uniquement en aérobiose : bactérie oxydative. La bactérie n’utilise pas le glucose : elle est inerte vis-à-vis du glucose. BIO303 Rédigé par Chringel Page | 7 King A et King B – milieu différentiel Composition King A  Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptone  Glucide et dérivés : glycérol  Autres molécules carbonées : /  Indicateurs S2- : /  Inhibiteurs : /  Divers : /  Indicateurs de pH : /  Ions minéraux : MgCl2 (chlorure de magnésium), K2SO4 (sulfate de potasssium)  Agar : oui  Eau : oui Composition King B  Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : polypeptone  Glucide et dérivés : glycérol  Autres molécules carbonées : /  Indicateurs S2- : /  Inhibiteurs : /  Divers : /  Indicateurs de pH : /  Ions minéraux : MgSO4 (sulfate de magnésium), K2HPO4 (hydrogénophosphate de potassium)  Agar : oui  Eau : oui Caractéristiques  La gélose est inclinée dans un tube.  Ensemencement en stries.  Le chlorure de magnésium et le sulfate de potassium favorisent la production de pyocyanine.  Le sulfate de magnésium et le phosphate bipotassique favorisent la production de pyoverdine.  King A : recherche de production de pyocyanine.  King B : recherche de production de pyoverdine. Usage  Identification des Pseudomonas par la présence de pyocyanine ou de pyoverdine. Technique  Inoculer un tube de milieu A et un tube de milieu B en faisant une strie médiane à la surface de la gélose avec une anse de culture prise dans un bouillon ou sur une gélose.  Replacer la capsule sur chaque tube sans la reviser. Lecture  Aspect après 24h minimum à 30°C : o King A : culture colorée en bleu-vert (pyocyanine +) et parfois en brun-rose (pyoverdine +). BIO303 Rédigé par Chringel Page | 8 En cas de doute, prélever l’eau de condensation à la pipette Paster et verser 0,5mL de chloroforme sur la pente du milieu. Laisser 5 à 10min en position inclinée. La pyocyanine colore le chloroforme en bleu. o King B : culture colorée en vert fluorescent (pyoverdine +).  Interprétation : o Pyocyanine + : présence de Pseudomonas aeruginosa. o Pyoverdine + : présence de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens et Pseudomonas putida. Gélose de Mac Conkey – milieu sélectif Composition  Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptone  Glucide et dérivés : lactose  Autres molécules carbonées : /  Indicateurs S2- : /  Inhibiteurs : Cristal violet, sels biliaires  Divers : /  Indicateurs de pH : Rouge neutre  Ions minéraux : NaCl  Agar : oui  Eau : non Caractéristiques  Sels biliaires : inhibiteur des Gram +  Cristal violet : inhibiteur des Gram +  Si la bactérie fermente le lactose, le milieu devient rouge du fait de l’acidification du milieu.  Ensemencement en cadrans.  Incubation 18 à 24h à 37°C Usage  Détermine si la bactérie fermente le lactose ou pas. Utilisé pour Shigella et Salmonella. Lecture  Lactose + : colonies rouges entourées d’un halo uploads/Geographie/ bio303-les-milieux-de-culture-pdf.pdf