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MODE OPERATOIRE Réf : CQ-MO-XXX Version : a CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE L’EXCIP

MODE OPERATOIRE Réf : CQ-MO-XXX Version : a CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE L’EXCIPIENT LUDIPRESS Copie N° : ORIGINE : CQ Date d’application : Page 1 sur 8 « Document confidentiel, toute photocopie de ce document est interdite » REDIGEE PAR VERIFIEE PAR APPROUVE PAR NOM A.B FONCTION DATE VISA Historique des modifications Version Date de modification Raison de la modification Pages portant des modifications a 25/04/2011 Création Diffusion 1- Responsable Assurance Qualité 2- Responsable Contrôle Qualité 3- Responsable Microbiologie 4- Copie pour affichage MODE OPERATOIRE Réf : CQ-MO-XXX Version : a CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE L’EXCIPIENT LUDIPRESS Copie N° : ORIGINE : CQ Date d’application : Page 2 sur 8 « Document confidentiel, toute photocopie de ce document est interdite » 1. Objet L’objet de cette procédure est de déterminer les modalités de contrôle du niveau de contamination microbienne de l’excipient LUDIPRESS. 2. Domaine d’application Cette procédure s’applique dans le cadre d’un contrôle normal porté sur LUDIPRESS en poudre. 3. Documents associes et références - Handbook of pharmaceutical recipients 6Ed (2009). - Procédure : « contrôle microbiologique des produits non obligatoirement stériles ». - Procédure : « lecture et interprétation des résultats d’analyse ». 4. Responsabilités - L’analyste microbiologiste. - Le responsable du laboratoire de microbiologie. - Le Responsable de Contrôle de qualité 5. Définitions et abréviations - FAVT : Flore Aérobie Viable Totale. - LMT : Levures et Moisissures Totales. - UFC : Unité Formant Colonie. 6. Contenu 6.1. Principe C'est l’estimation de la flore aérobie viable totale et la recherche et le dénombrement des microorganismes spécifiques, à savoir : Staphyloccocus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et salmonella sp en utilisant une méthode de choix pour le dénombrement et la recherche des microorganismes. 6.2. Matériels  Équipement : – Bain-marie. – Balance de précision. – Agitateur. – Compteur de colonies. – Étuves à 30-35°C, 20-25°C, 44°C. – pH-mètre. MODE OPERATOIRE Réf : CQ-MO-XXX Version : a CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE L’EXCIPIENT LUDIPRESS Copie N° : ORIGINE : CQ Date d’application : Page 3 sur 8 « Document confidentiel, toute photocopie de ce document est interdite » – Anse de platine – Bec Bunsen. – rampe à filtration. – Membranes à filtration avec porosité de 0,45 µm.  Consommables et verrerie : – Boîtes de Pétri. – Pipettes Pasteur. – Pipettes graduées de différents volumes. – Pinces stériles – Tubes à vis stériles. – portoirs. – Flacons stériles de 100, 300 et 500 ml, Erlenmeyers, béchers, fioles.  Solutions : – Eau distillée stérile. – Eau javellisée. – Solution tampon peptonée au chlorure de sodium pH= 7 stérile. – Solution de Polysorbate 80 à 1 g/l.  Milieux de culture liquides : – Milieu liquide A : milieu liquide aux peptones de caséine et de soja. – Milieu d'enrichissement E : milieu d'enrichissement pour les entérobactéries, Mossel. – Milieu liquide G : milieu liquide de Mac Conkey. – Milieu I : milieu au tétrathionate – bile – vert brillant.  Milieux de culture gélosés : – Milieu Gélosé B : milieu gélosé aux peptones de caséine et de soja. – Milieu Gélosé C : milieu Sabouraud – glucosé – gélosé avec chloramphénicol. – Milieu gélosé H : milieu gélosé de Mac Conkey. – Milieu gélosé K : milieu gélosé – xylose – lysine – désoxycholate. – Milieu gélosé M : milieu gélosé – fer – trois sucres. – Milieu gélosé N : milieu gélosé – cétrimide. – Milieu gélosé O : milieu Baird – Parker. 6.3. Définition de l’excipient LUDIPRESS est une mixture entre le lactose monohydrate (96,5% ± 1,8%) et le povidon (3,5% ± 0,5%). Il se présente sous forme de granules blancs à écoulement libre, inodore avec un goût neutre. Il est soluble dans l’eau. 6.4. Echantillonnage et préparation de l’échantillon pour essai - Plan d’échantillonnage : se rapporter à l’annexe02. - A l’aide d’un échantillonneur, prélever 10g de la poudre de l’excipient en prenant en compte les précautions mentionnées dans la procédure « Echantillonnage et prélèvement », MODE OPERATOIRE Réf : CQ-MO-XXX Version : a CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE L’EXCIPIENT LUDIPRESS Copie N° : ORIGINE : CQ Date d’application : Page 4 sur 8 « Document confidentiel, toute photocopie de ce document est interdite » - Afin d’obtenir 10g comme étant la quantité nécessaire pour le test, mélanger plusieurs prélèvements effectués au hasard dans la masse du produit. - Préparer une dilution au 1/10ème en dessoudant 10g de l’excipient dans 90 ml de la solution tampon peptonée au chlorure de sodium pH7 ou dans un autre diluant approprié additionnée de polysorbate 80 à 1 g/l. On doit donc obtenir 100 ml de suspension corresponde à 10 g de l’excipient. - Ajuster à pH de 6 à 8, si nécessaire. - Préparer d’autres dilutions, si nécessaire, à l’aide du même diluant. 6.5. Dénombrement de la flore aérobie viable totale en milieu solide en boites de Pétri (=comptage sur plaque de gélose) 6.5.1. Dénombrement après ensemencement en masse (Méthode 01) - Porter aseptiquement 1 ml de la suspension dans chaque boite de pétri vide :  Pour le dénombrement des microorganismes totaux : - Ajouter 15 ml à 20 ml du milieu gélosé B fondu et refroidi à 45°C. - Faire ensuite des mouvements circulaire et de va- et- vient en forme de « 8 ». - Incuber à 30 – 35 °C pendant 24 à 48 heures.  Pour dénombrement des levures et moisissures totales : - Ajouter 15 à 20 ml du milieu gélosé C fondu puis refroidi à 45°C. - Homogénéiser en faisant des mouvements circulaires. - Incuber à 20 – 25 °C pendant 3 – 5 jours. - Effectuer le travail en double. - Effectuer un contrôle négatif. 6.5.2. Dénombrement après filtration sur membrane (Méthode 03) - Préparer une dilution au 1/10ème (cf. chapitre 7.4.) mais on augmente le volume jusqu’à 500. On doit donc obtenir 500 ml de suspension corresponde à 50 g de l’excipient. - Vérifier l’impureté de la solution mer pour ne pas affecter la rétention des microorganismes. - En utilisant un filtre 0.45 µm, filtrer 100 ml de la solution préparée pour chaque boite. - Déposer aseptiquement la membrane destinée à la numération des FAVT sur la surface du milieu gélosé B coulé dans une boite de Pétri. - Déposer aseptiquement la membrane destinée à la numération des LMT sur le milieu gélosé Sabouraud+ Chloramphénicol. - Incuber à 30 – 35 °C pendant 24 à 48 heures pour les germes totaux et à 20 – 25 °C pendant 3 à 5 jours pour les levures et moisissures. - Effectuer l’opération en double pour chaque milieu de culture et pour chaque dilution. - Effectuer un contrôle négatif. 6.5.3. Lecture et interprétation des résultats - Première lecture : après 24 h pour FAVT et après 3 jours pour LMT. - Deuxième lecture : après 48 h pour FAMT et après 5 jours pour LMT. MODE OPERATOIRE Réf : CQ-MO-XXX Version : a CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DE L’EXCIPIENT LUDIPRESS Copie N° : ORIGINE : CQ Date d’application : Page 5 sur 8 « Document confidentiel, toute photocopie de ce document est interdite » - Utiliser les boites qui présentent un nombre de colonies inferieur ou égale à 300 colonies pour FAVT et inferieur ou égale à 100 colonies pour LMT. - Calculer le nombre d’UFC / ml présents dans la suspension d’essai comme a été indiqué dans la procédure « lecture et interprétation des résultats d’analyses» - Rendre le résultat en UFC par gramme de l’excipient.  Remarque : Pour la technique de filtration sur membrane, calculer et exprimer les résultats par rapport à la quantité de liquide filtrée, c.-à-d, en UFC/100 ml, puis rendre le résultat en UFC/g de l’excipient. 6.6. Recherche d’Escherichia coli  Test de présomption : - Préparer l’échantillon d’essai (cf. chapitre 6.4). - Inoculer 100 ml du milieu TSB avec 10 ml de l’échantillon d’essai. - Mélanger. - incuber à 30-35 °C pendant 18-24 heurs (pré-enrichissement). - Après incubation, homogénéiser puis transférer 1 ml du bouillon pour inoculer 100 ml du bouillon Mac Conkey (enrichissement). - Incuber à 42 - 44 °C pendant 24 h. - Après incubation, effectuer des subcultures sur milieu gélosé Mac Conkey. - Incuber 30 – 35 °C pendant 18-48 h. - Effectuer un contrôle négatif.  Lecture et interprétation : - L’apparition des colonies à couleur jaune sur milieu gélosé Mac Conkey indique la présence possible d’E. coli, à confirmer par le test de confirmation.  Remarque : Le test de confirmation consiste à identifier les germes par des tests complémentaires, par exemple test de production d’indole et production du gaz ou on se contente directement à une identification biochimique (galeries classiques ou Api) 6.7. Recherche des salmonelles  Test de présomption : - Préparer l’échantillon d’essai (cf. chapitre 7.4). - Utiliser toute la quantité (100 ml) pour inoculer 200 ml du bouillon TSB. - Homogénéiser et incuber à 30 – 35 °C pendant 18-24h (pré-enrichissement). - Après incubation, transférer 0,1 ml et ensemencer 10 ml de Tetrathionate bile – vert brillant (milieu liquide I) ou un autre milieu uploads/Geographie/ c-m-des-excipients-ludipress.pdf