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Identification des pollens dans le miel par coloration et observation au micros

Identification des pollens dans le miel par coloration et observation au microscope optique M58 Julie Chêne Session 2015/2017 Partenaires : Rucher école Lecomte Marcel Epreuve E7-2 Étiquetage miels monofloraux possible ? En effet, miel = matrice indépendante où l'homme ne peut contrôler son origine florale à 100 %. Analyses polliniques identifient les plantes butinées à l’origine de la production du miel + permettent détermination de l’appellation correcte du produit commercialisé. Projet M58 porté sur le contrôle des pollens contenus dans 4 miels différents. Par méthodes de coloration de masse puis examen au microscope du miel. Les résultats seront complétés par d'autres obtenus par PCR par un autre groupe pour améliorer la quantification des pollens et confirmer nos valeurs. Cependant l'identification des pollens est longue soit en premier lieu, le projet demande la réalisation d'une méthodologie de reconnaissance. Fiche de synthèse Contexte : Le pollen est l'organe reproducteur mâle de la fleur. Il joue son rôle en étant transporté par les insectes pollinisateurs et les éléments. Il se retrouve dans le miel, substance sucrée produite par les abeilles. D'après le M58 de l'année passée et l'avis de notre partenaire M.Lecomte nous avons choisi 3 colorants : Fushine de Zhiel, Vert d'iode et Safranine pour colorer les lames. Nos colorants retenus sont caractérisés de létaux. Ils réagissent avec les protéines de la paroi du pollen et marquer ainsi un contraste. Biblio. scientifique : Biblio. technique : Nos résultats bruts se caractérisent par des photos de pollens reconnus ou inconnus. Par la suite nous avons élaborés nos résultats sous forme de diagramme pour en conclure le pourcentage de pollens présents dans un miel. Il est est conclu que pour un miel dis monofloral sa composition repose majoritairement sur le pollen de son appellation. En comparant nos résultats à ceux obtenus par PCR nous pouvons confirmer nos résultats. Cependant les données obtenues par PCR ne sont pas représentatives de la totalités des pollens présents dans le miel. Résultats : (1) diluer le miel dans de l'eau à 40°C (2) Centrifuger 20min. à 4000tr/min (3) Retirer le surnageant, remplir le tube d'eau et recommencer pendant 10min. Protocole : Ce projet m'a permis d'enrichir mes Compétences en travail de groupe. J'ai également enrichi mes connaissances sur la fabrication du miel et sa composition. Le travail en groupe et en autonomie est une excellente expérience en ce qui concerne le milieu professionnel par la suite. (4) Vider le surnageant, mélanger le culot (5) Transférer une goutte Sur une lame (6) Déposer une goutte de colorant sur la lame et effectuer le montage (7) Faire un comptage sur 100 pollens par lame Conclusion Personnelle : Table des matières Table des matières Introduction......................................................................................................................................1 I - Bibliographie :............................................................................................................................2 1. Bibliographie scientifique : du miel au pollen.......................................................................................2 2. Bibliographie techniques : les colorants.................................................................................................2 3. Les partenaires.............................................................................................................................................3 II. Protocole.....................................................................................................................................4 1. Résultats attendus........................................................................................................................................4 2. Résultats brut obtenus :.............................................................................................................................5 3. Résultats élaborés et discussion..............................................................................................................6 IV. Conclusion...................................................................................................................................8 Annexe 1 : Budget............................................................................................................................9 Annexe 2 : Planning.........................................................................................................................9 Annexe 3 : Bibliographie liens internet :................................................................................10 Annexe 4: tableau d'identification des pollens :..................................................................10 Remerciements : Je souhaite remercier en premier lieu monsieur Marcel Lecomte, pour ses conseils sur les techniques de coloration et les colorants à favoriser pour notre projet. Je remercie également le rucher école, miellerie, qui nous a fournis des échantillons de miel variés à analyser et des informations sur notre bibliographie scientifique. Introduction De nos jours la consommation de miel augmente. Effectivement le produit attire les consommateurs pour certaines de ses vertus notamment anti-oxydantes et sa fabrication naturelle. En effet, les apiculteurs ne peuvent contrôler le trajet de leur abeilles, la création du miel se réalise sans la main de l'homme et dépend des saisons, du climat du sol mais aussi des plantes, ce qui peut alors donner différents goûts pour un miel portant le même nom selon les pays ou régions. Dans la création du miel l'homme intervient uniquement lors de la conduite de rucher, afin de favoriser la pollinisation de certains arbres par leurs abeilles, et de la récolte. Ainsi les apiculteurs peuvent orienter leur vente sur des produits dit "mono-floraux", cette appellation permet au producteur de vendre son miel à un prix plus élevé et de mieux le caractériser dans certaines vertus, que ceux dis « toutes fleurs ». Cependant le miel reste un des produits les plus compliqués à caractériser dans sa composition sur un étiquetage. Comment est-on certain qu’il n’y ait donc qu'une espèce de fleur dans un miel qui lui est dit spécifique sachant que l'homme ne peut intervenir dans sa création ? Des analyses polliniques permettent de déterminer l’appellation correcte du produit commercialisé. Ces analyses identifient les plantes butinées à l’origine de la production du miel et permettent ainsi la détection des fraudes concernant l’étiquetage des produits. Cependant, il est normal de retrouver certains pollens environnants dans des miels dit mono-floraux. Malheureusement la quantification de ces autres pollens est difficile à réaliser. En effet La variété de pollen est large et certains ce ressemblent énormément. C'est pour cela que des techniques quantitatives de laboratoires plus pointues se développent tel la PCR (Polymerase Chain Reaction). Ces analyses pourront dans un futur proche permettre la détermination des certification AOP ou AOC ou certaines appellations BIO sur certains miels, selon des normes non déterminée à ce jour. Dans le cadre de notre projet scientifique M58, nous avons choisi de mettre en place un contrôle sur les pollens contenus dans 4 miels différents, avec un de châtaigner, de tilleul, de tournesol et de toutes fleurs. En finalité notre projet est de permettre l’étiquetage de ces miels grâce à la méthodes de coloration de masse pour donner suite à un examen au microscope du miel, ce qui permettra d’en préciser son origine florale. De plus nous compléterons nos résultats avec d'autres obtenus par PCR par un autre groupe pour améliorer la quantification des pollens et confirmer nos valeurs. Cependant l'identification des pollens peut être longue et laborieuse, c'est pour cela que nous réaliserons en premier lieu une méthodologie de reconnaissance. 1 I - Bibliographie : 1. Bibliographie scientifique : du miel au pollen Le miel est est une substance sucrée produite par les abeilles à partir de nectar ou de miellat. Il est constitué d'eau, de sucres (glucose, fructose..) et d'autres composants tel le pollen. Les grains de pollens proviennent des fleurs, on les y trouvent sous forme de cellules de forme plus ou moins ronde et dont la surface mais aussi la taille varie selon les espèces. Il se situent dans des loges à pollen situées dans les étamines de la plante. Ils effectuent ainsi un rôle d'organe reproducteur mâle. Un grain de pollen va donc servir à féconder les ovules situés dans les ovaires de la plante (voir figure 2). Un grain de pollen contrairement aux cellules, possède deux noyaux: un noyau végétatif et un noyau reproducteur. Pour remplir son rôle, il doit être transporté par l’eau, le vent, ou les insectes pollinisateurs (comme les abeilles) sur les stigmates des fleurs. Une fois transporté, celui-ci sera hydratépar des sucs et va germer, grâce à son noyau végétatif. Un tube pollinique va se former afin de faire transiter le noyau reproducteur vers les ovules qui une fois fécondés vont dans la majeure partie des cas former une graine. L’analyse de ces grains de pollen permet donc d’identifier les fleurs visitées par les abeilles mais aussi de quantifier les diverses proportions dans le cas de miel de fleurs d’origines variées ou bien de détecter les fraudes. La mélissopalynologie est le nom donné à cette étude. De même, la mélissopalynologie intervient dans le repérage des miels de sucre, obtenus frauduleusement par nourrissage des abeilles au saccharose, mais aussi dans le contrôle et l'expertise des produits alimentaires, diététiques et cosmétiques à base de pollen, de miel ou de gelée royale. 2. Bibliographie techniques : les colorants Notre manipulation consiste à colorer les grains de pollens afin de mieux les identifier et les repérer au microscope. Pour cela nous nous sommes basés sur le projet M58 de 2016 qui précédait le notre. Nous avons donc retenus les trois colorants ayant le mieux fonctionné lors de leur manipulation. Il faut savoir qu'il faut utiliser ces réactifs avec précautions car ceux-ci sont toxiques par voie orale et irritant et tachant sur la peau. On utilisera donc : La fushine de zielh : C’est un colorant de couleur rouge/rose qui est notamment utilisé dans la coloration de gram. Les sels de cette dernière sont intéressants à cause de leur plus grande 2 Illustration 2: processus de pollinisation Illustration 1: schéma d'un grain de pollen solubilité. La fuchsine de Ziehl est aussi connue sous les noms de fuchsine phéniquée de Ziehl ou encore rouge de Ziehl. Le vert d’iode : C’est un colorant de couleur verte utilisé dans la coloration de noyau cellulaire en botanique. C’est un colorant basique qui n’existe qu’à l’état de sel car sa base est incolore. Le vert d’iode est un colorant exceptionnel en cytologie et histologie végétales, lorsqu’il est utilisé en parallèle avec le carmin aluné. uploads/Geographie/ coloration-des-pollens.pdf