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Faculté de Médecine d’Annaba Département de Pharmacie Physiologie bactérienne I

Faculté de Médecine d’Annaba Département de Pharmacie Physiologie bactérienne II Métabolisme Bactérien 1. Introduction : Le métabolisme est l’ensemble des réactions chimiques qui se déroulent dans les cellules vivantes : il y a construction (anabolisme), dégradation (catabolisme) ou modification de molécules, oxydation ou réduction de divers atomes. La plupart de ces réactions font intervenir des catalyseurs protéiques spécifiques appelés enzymes. Une suite de réactions métaboliques, au cours de laquelle une substance est convertie en une ou plusieurs autres, constitue une voie métabolique. En parcourant une telle voie, le substrat est transformé, souvent via un ou plusieurs intermédiaires, en ce qu’on appelle des produits finaux. Les réactions métaboliques sont le plus souvent endergoniques c'est-à-dire qu’elles requièrent de l’énergie. 2. La respiration : La respiration est un type de métabolisme convertisseur d’énergie au cours duquel le substrat est métabolisé avec intervention d’un agent oxydant exogène. La respiration peut avoir lieu en présence d’oxygène (agent oxydant externe) mais elle peut aussi s’effectuer en anaérobiose (lorsque d’autres agents organiques ou inorganiques remplacent l’oxygène). 2.1. La respiration aérobie : Au cours de la respiration aérobie des bactéries, la production d’ATP à partir d’ADP et de Pi s’effectue grâce à l’énergie accumulée par le fonctionnement de la chaîne respiratoire localisée dans la membrane cytoplasmique. La chaîne respiratoire et phosphorylation oxydative: Dans les chaînes respiratoires, on trouve : des cytochromes, des protéines fer- soufre et des quinones. Ces constituants sont disposés de façon séquentielle en fonction de leurs potentiel redox de telle sorte que ce potentiel augmente jusqu’à l’accepteur final. Le mouvement des électrons ou de l’hydrogène s’effectue de façon graduelle à partir des constituants les plus électronégatifs pour aller vers le composant le plus électropositif (l’oxygène chez les aérobies). Ce mouvement des électrons et des ions hydrogènes, crée une force proton motrice nécessaire à la production d’ATP. Dans la respiration, l’oxydation du NADH+H+ et du FADH2 formés lors des réactions cataboliques sont utilisés pour produire de l’ATP dans la chaîne de transfert d’électrons ; alors que dans le cas de la fermentation, la cellule doit se débarrasser du NADH+H+ en synthétisant un déchet comme l’acide lactique. La respiration aérobie se déroule en plusieurs étapes :  La glycolyse  Le cycle de Krebs ou cycle des acides tricarboxyliques  Chaîne de transfert des électrons et phosphorylation oxydative. 2.2. La respiration anaérobie : La respiration anaérobie est la même que la respiration aérobie, toutes deux utilisent un agent oxydant externe. Dans des conditions d’anaérobiose, des agents oxydants tels que le nitrate, le sulfate et le fumarate remplacent l’oxygène ; une chaîne respiratoire anaérobie peut donner naissance à une force proton motrice.  Dans la respiration nitrique, le nitrate sert d’accepteur final d’électrons. Il est ainsi réduit en nitrite, en oxyde nitreux, en azote ou en ammoniac.  Les bactéries réductrices de sulfates emploient le sulfate comme accepteur final d’électrons et le réduisent en sulfure.  Dans la respiration fumarique, l’accepteur final d’électrons est du fumarate exogène qui est réduit en succinate. 3. La fermentation : La fermentation est un type de métabolisme convertisseur d’énergie par lequel un substrat est métabolisé sans intervention d’un agent oxydant exogène. La fermentation a lieu généralement ; mais pas nécessairement ; en anaérobiose c'est-à-dire en l’absence d’oxygène. Puisqu’aucun agent oxydant externe n’est utilisé, les produits de fermentation ont le même degré d’oxydation que le substrat. La fermentation du glucose commence par la glycolyse ou la voie d’Embden- Meyerhof. Au cours de ce processus, une molécule de glucose va donner deux molécules de pyruvate, 2 ATP, 2NADH. En fonction du devenir du pyruvate, on distingue :  La fermentation lactique: lorsque l’acide lactique est le seul produit(ou produit prédominant), on parle de fermentation homolactique ; tandis qu’une fermentation hétérolactique donne un mélange d’acide lactique et d’autres produits.  La fermentation alcoolique: le pyruvate est décarboxylé en acétaldéhyde, celui-ci est alors réduit en éthanol par l’alcool déshydrogénase.  La fermentation butyrique: qui conduit à la production de quantités importantes de l’acide butyrique (anaérobies+++).  La fermentation formique: le pyruvate est métabolisé en acide formique et en d’autres substances. Il y a deux types de fermentation formique : La fermentation acide mixte: a lieu chez E.coli, Proteus, Salmonellan, Shigella. Elle aboutit à la production d’éthanol et d’un mélange complexe d’acides, en particulier les acides acétiques, lactique, succinique et formique. La fermentation butanediolique: est caractéristique de Klebsiella, Enteroabcter, Serratia. Le pyruvate est transformé en acétoïne qui est ensuite réduite en 2,3-butanediol. Application du Métabolisme à l’Identification Bactérienne : Identification Biochimique des Bactéries 1. Etude du métabolisme énergétique : 1.1. Détermination du type respiratoire : Le milieu d’étude type est la gélose VF (viande-foie). Le milieu est coulé en tubes. Avant d’être ensemencés, les tubes doivent être régénérés par séjour d’une demi-heure au bain-marie bouillant (abaisser le potentiel redox des milieux). Ensemencer à la pipette Pasteur du fond jusqu’à la surface en décrivant des tours de spires serrés. Incuber à l’étuve 18-24h à 37°C. Lecture :  Les bactéries qui se développent en surface sont des bactéries aérobies strictes. Ex : Pseudomonas  Les bactéries qui cultivent sur toute la hauteur du tube sont dites aéro- anaérobies facultatives. 1.2. Recherche de la catalase : La catalase empêche l’accumulation du peroxyde d’hydrogène (H2O2) en le décomposant en eau et oxygène. Déposer sur une lame une goutte d’eau oxygéné à 10 volumes et y dissocier une ou quelques colonies de bactéries prélevées sur milieu solide (mais jamais à partir d’une gélose au sang). Lecture : Le dégagement immédiat de bulles gazeuses signe la présence d’une catalase. 1.3. Recherche de l’oxydase : Le cytochrome oxydase (cytochrome C, aa3) a la propriété d’oxyder le diméthyl- ou tétraméthyl-paraphénylènediamine en une semi-quinone rouge. Le test se fait sur disques imprégné de réactifs. 1.4. Recherche des nitrates-réductases : Se fait par la mise en évidence des nitrites formés lors de la réaction de Griess : les nitrites,en milieu acétique ou sulfurique, donnent une coloration rouge en présence d’acide parasulfanilique(réactif Nit1) et d’alpha naphtylamine (réactif Nit2). Le milieu utilisé est le bouillon nitraté. Toutefois, certaines bactéries réduisent le nitrates au-delà du stade ‘’nitrites ‘’, la réaction doit être complétée par l’épreuve de Zo-Bell, épreuve qui consiste à ajouter un peu de poudre de zinc au milieu :  Si le zinc réduit les nitrates encore présents en nitrites : la coloration rose apparait, la réaction est alors négative (bactérie dépourvue de nitrates réductase) ;  Si, au contraire la teinte du milieu reste inchangée, le stade nitrite a été dépassé : bactéries possédant une nitrate réductase très active. 2. Etude du métabolisme glucidique : 2.1. Détermination du type du métabolisme du glucose (voie fermentative ou voie oxydative) : Milieu utilisé : le milieu MEVAG (milieu d’étude de la voie d’attaque des glucides). Les tubes doivent être régénérés avant ensemencement (ébullition). L’ensemencement se fait par piqûre centrale de 02 tubes, à partir d’une suspension riche du germe à étudier : un tube est incubé tel quel (appelé tube ouvert), tandis que l’autre est recouvert d’une couche de 1 à 1.5 cm de vaseline stérile (tube fermé). Il est prudent de prévoir un tube témoin ne renfermant pas de glucide et qui ne devra jamais être acidifié. Incuber en ne revissant pas à fond la capsule ou le capuchon des tubes. Lecture : a). bactéries fermentatives ou fermentaires : acidification rapide et égale dans les deux milieux qui deviennent jaunes sur toute la hauteur de la piqûre d’inoculation. b). bactéries oxydatives : absence de culture dans le tube fermé et donc pas d’acidification (couleur inchangée ou teinte orangée) ; acidification modérée et lente dans le tube ouvert, débutant à la surface, en 24-48h. 2.2. Milieu TSI (tri-sugar-iron) : Milieu complexe ; comportant une pente et un culot, de couleur rouge-brique ; permettant de confirmer la fermentation du glucose, l’attaque du lactose, du saccharose, la production de gaz, la production d’H2S. L’ensemencement se fait par stries serrées sur la pente et piqûre centrale dans le culot. Lecture : a). la fermentation du glucose se traduit par une acidification du culot (virage au jaune) b). la dégradation du lactose et du saccharose se produit au niveau de la pente avec virage au jaune. c). la production de gaz se traduit par la présence d’un vide ou le décollement de la gélose. d). la production d’H2S se traduit par un noircissement partiel ou complet de tube. 2.3. Milieu KIA (Kligler-Iron-Agar) ou milieu Hajna Kligler : Il s’agit d’un milieu TSI dépourvu de saccharose. La lecture se fait de la même façon pour les autres caractères. 2.4. Dégradation du mannitol : milieu mannitol-mobilité-nitrate : Le milieu mannitol-mobilité-nitrate (milieu gélosé de couleur rouge) : permet de rechercher simultanément la fermentation du mannitol (produit de réduction du D-mannose), la mobilité, la réduction des nitrates en nitrites. Ensemencer par piqûre centrale à partir de culture en milieu solide ou liquide. Lecture : a). la fermentation du mannitol entraine le virage au jaune du milieu. b). les bactéries mobiles diffusent à partir de la ligne d’ensemencement en créant un trouble du milieu. c). en versant uploads/Geographie/ metabolisme-bacterien-pharmacie.pdf