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page 1 1 TP DE MICROBIOLOGIE - ANNEE 2010-2011 Licence Sciences, Technologies,

page 1 1 TP DE MICROBIOLOGIE - ANNEE 2010-2011 Licence Sciences, Technologies, Santé mention Biologie UE 6.3 b : Bactériologie et Virologie Générales MATERIEL : Travail en binôme - une blouse en coton Etuve : groupe du matin, étage du haut - un feutre indélébile groupe de l’après midi, étage du bas - un élastique à cheveux Pipetage uniquement avec poires 1ère semaine PROGRAMME DU TP : LE COURS ET LES TD DOIVENT ETRE COMPRIS Travail stérile Identification de 3 souches Identification présomptive de souches d’un mélange - Techniques de base : - Travail stérile - Etat frais - Coloration de Gram - Ensemencement - Isolement sur milieux gélosés sélectifs et non sélectifs - Identification bactérienne par l’étude des caractères métaboliques et antigéniques I - TRAVAIL STERILE (J1, J2) 1) J1 A partir d’un bouillon Trypticase Soja (TS) de 10 mL (tube à essai), transvaser stérilement ≈ 2 mL dans 5 tubes à hémolyse à l’aide d’une pipette Pasteur. - 2 bouillons serviront au test de stérilité : les incuber 24h à 37°C. - les 3 autres bouillons serviront pour l’identification des 3 souches (voir II). 2) J2 Les 2 bouillons non ensemencés sont-ils limpides ? Conclusion. II - IDENTIFICATION DE 3 SOUCHES (J1, J2, J3) Chaque binôme reçoit 3 souches isolées sur gélose TS en vue d’une identification. 1) J1 - Caractères morphologiques. Pour chacune des 3 souches, réaliser séparément : - Gram (objectif x 100 à l’immersion). Dessiner la forme exacte (allongée, ovale, ronde, incurvée, …). Préciser le groupement. - Etude de la mobilité - ensemencement d’un milieu semi-solide mannitol-mobilité : piqûre centrale avec 1 colonie. - ensemencement d’un bouillon TS de ˜ 2 mL avec 1 colonie. - Réisolement - Faire sécher 3 géloses TS 30 min. à l’étuve. - Isoler à partir du bouillon TS ensemencé par 1 colonie chaque souche sur une gélose TS par la méthode des quadrants. Flamber entre chaque quadrant. Semaine 1 2 2) J2 Etudier sur les 3 souches : - Caractères morphologiques. - étude de la mobilité : - lecture du milieu mannitol-mobilité. - état frais entre lame et lamelle à partir du bouillon TS (objectif x 40 à sec). - étude macroscopique des colonies - Métabolisme énergétique - TESTS à REALISER SUR LA MEME LAME - - catalase : Déposer 1 goutte de H2O2 puis les colonies avec 1 pipette Pasteur. - oxydase : Déposer 1 papier buvard avec 1 goutte de TMPD. Déposer les colonies avec une pipette Pasteur à la limite de la goutte et du buvard sec. Le test est + si c’est la colonie qui vire qu rouge. Etudier selon l’identification présomptive de la famille ou du genre : - Caractères métaboliques - pour bacilles Gram - Lecture de la fermentation du mannitol sur le milieu mannitol-mobilité ensemencé en J1. Ensemencement d’une galerie d’identification simplifiée en tubes (voir fiches techniques) : - milieu de Kligler-Hajna - milieu de Clark et Lubs (pour réaction de RM et VP) - milieu urée-indole de Ferguson - recherche de la nitrate réductase sur mannitol-mobilité. Ensemencement d’une galerie API 10E. - pour staphylocoques (coques Gram +, catalase +) Lecture de la fermentation du mannitol (cf. ci-dessus). Recherche d’une DNAse : ensemencer une gélose à l’ADN. Recherche d’une coagulase : agglutination de particules de latex sensibilisées par du fibrinogène. - pour streptocoques (coques Gram +, catalase -) Lecture de la fermentation du mannitol (cf. ci-dessus). Etude des caractères antigèniques (à faire éventuellement J3) : Recherche du polyoside C pariétal : 1- extraction du polyoside C : mettre 20 colonies en suspension dans 0.5 mL d’enzyme d’extraction. Incuber 10 min. à 37°C au bain-marie 2- réaction d’agglutination de particules de latex sensibilisées par des anticorps spécifiques de chaque polyoside C de groupe A, B, C et D. 3) J3 - pour bacilles Gram - Révélation et lecture de la galerie d’identification en tubes. Test ONPG : uniquement si la bactérie est lactose - (voir milieu de Kligler-Hajna). Révélation et lecture de la galerie API 10E. Comparaison des résultats obtenus par les 2 méthodes. - pour les staphylocoques Révélation de la DNAse. Semaine 1 3 III - ETUDE D’UN MELANGE DE GERMES (J1, J2, J3) Chaque binôme reçoit un bouillon TS renfermant un mélange de germes. 1) J1 - Etude morphologique - Etat frais : mettre 1 anse de bouillon entre lame et lamelle. Observer (cf. fiche technique). - Gram : mettre 2 gouttes de pipette Pasteur sur une lame. - présomption : types de germes présents (forme, groupement, mobilité, Gram) - choix de milieux de culture sélectifs ou non pour l’isolement de ces bactéries - Isolement sur milieux solides : Faire sécher les géloses 30 min. à l’étuve avant l’isolement - sur milieu non sélectif (gélose TS) qui permettra la croissance de toutes les bactéries - sur milieu(x) sélectif(s) si nécessaire pour inhiber certaines bactéries : - milieu de Chapman sélectif pour staphylocoques et microcoques - milieu de Drigalski sélectif pour bacilles Gram - courants (entérobactéries, Pseudomonas, Vibrion). 2) J2 - Voir la qualité des isolements. Si besoin, réisoler. - Lecture des milieux Chapman et Drigalski. - Comparaison des isolements entre eux. Aspect macroscopique des colonies. - Identification présomptive de chaque germe : - Gram - oxydase - catalase - type respiratoire : Lecture des géloses Viande Foie (VF). VOIR clichés fournis Les géloses VF ont été ainsi préparées. Les VF sont préalablement régénérées 20 min. au bain- marie bouillant et ramenées à ˜ 55°C. Elles sont ensemencées avec une colonie sur toute la hauteur du tube puis solidifiées immédiatement en passant le tube sous l’eau froide. Les VF sont incubées 24h à 37°C. Le bouchon est légèrement dévissé pour laisser l’air pénétrer. AUCUN AUTRE TEST à faire 3) J3 Finir les lectures des tests. COMPTE RENDU par binôme : à rendre impérativement en J3 à la fin de la séance : - Travail stérile. - Identification des souches : classer les résultats par souche ; regrouper les tests pour dégager la logique de la démarche d’une identification. - Identification présomptive des germes du mélange. - Inclure une note sur : - principe et mode de lecture des milieux TS, Chapman et Drigalski. - principe et mode de lecture des milieux Kligler, Clark et Lubs, urée-indole et du test de la recherche de la nitrate réductase. - définition des entérobactéries. NB : - Ne pas oublier le n° des 3 souches étudiées et la lettre du mélange. - Les comptes-rendus ne doivent pas décrire les techniques utilisées mais doivent comporter les résultats et la démarche suivie si possible sous forme de tableau. Semaine 1 4 TP DE MICROBIOLOGIE - ANNEE 2010-2011 Licence Sciences, Technologies, Santé mention Biologie UE 6.3 b : Bactériologie et Virologie Générales 2ème semaine PROGRAMME DU TP : I - CMI et CMB vis à vis de la streptomycine - Dénombrements bactériens II - Mutation - Antibiogrammes par diffusion en gélose III - Conjugaison - Antibiogrammes par diffusion en gélose IV - Examen individuel I - CMI et CMB VIS A VIS DE LA STREPTOMYCINE (J1, J2, J3) CMI : plus faible concentration d’antibiotique inhibant toute croissance visible CMB : plus faible concentration d’antibiotique ne laissant subsister que 0.01% de l’inoculum initial Une solution mère d’antibiotique à 10 g/L est distribuée. Calculer le volume de solution mère d’antibiotique à ajouter pour avoir 2 mL de milieu à 1024 mg/L. 1) J1 : Préparation commune aux CMI et CMB : - Inoculer un bouillon TS avec 1 colonie de la souche donnée sur gélose TS et incuber ce bouillon 1 à 2h à 37°C en bain-marie agité. - Préparer pendant ce temps la gamme de dilution de l’antibiotique (solution mère à 10 g/L): Préparer dans des tubes à hémolyse bouchés coton des dilutions géométriques de raison 2 de l’antibiotique dans du bouillon MH stérile sous un volume final de 1 mL de façon à obtenir une gamme allant de 1024 à 8 mg/L et 1 tube témoin sans antibiotique soit 9 tubes. - Préparer une dilution du bouillon de culture au moins au 1/10 en bouillon MH (cette dilution doit être parfaitement limpide). Répartir 1 mL de cette dilution dans chaque tube de la gamme d’antibiotique (la concentration finale en antibiotique va de 512 à 4 mg/L). Commencer par le tube témoin. - Numération de l’inoculum initial. - Faire sécher 30 min. 1 gélose TS avant utilisation - Le tube témoin sans antibiotique (1 mL de bouillon MH + 1 mL de suspension bactérienne diluée au 1/10 en bouillon MH) est utilisé pour évaluer l’inoculum initial (il devrait renfermer ≅ 106 bactéries viables/mL) : Faire 4 dilutions de raison 10 en eau distillée stérile (50 µL dans 450 µL) : 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 qui serviront pour l’interprétation des CMB car elles correspondent respectivement à 10%, 1% 0.1% et 0.01% de survivants. Ensemencer 50 µL des différentes dilutions et de l’échantillon non dilué (100% de survivants) sur la gélose TS. - Incuber les tubes et les boîtes 18 à 24h à uploads/Geographie/ milieux-et-caracterisation-microbienne.pdf