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COMMUNAUTÉ FRANÇAISE DE BELGIQUE ACADÉMIE UNIVERSITAIRE WALLONIE-EUROPE FACULTÉ

COMMUNAUTÉ FRANÇAISE DE BELGIQUE ACADÉMIE UNIVERSITAIRE WALLONIE-EUROPE FACULTÉ UNIVERSITAIRE DES SCIENCES AGRONOMIQUES DE GEMBLOUX CARACTÉRISATION DU CONSORTIUM MICROBIEN D'UN GRAIN DE KÉFIR Véronique Louise NINANE Dissertation originale présentée en vue de l'obtention du grade de docteur en sciences agronomiques et ingénierie biologique Promoteur : Pr. Ph. THONART Co-promoteurs : Dr. P. DARDENNE, Dr. G. BERBEN 2008 Ninane Véronique Louise (2008). Caractérisation du consortium microbien d'un grain de kéfir. Gembloux, Faculté Universitaire des Sciences Agronomiques, 197 p., 16 tabl., 16 fig. Résumé: Les grains de kéfir sont des ferments lactiques constitués d'une microflore complexe et diversifiée. Celle d'un grain de kéfir (KJ) a été caractérisée par une approche méthodologique classique d'isolements microbiens sur des milieux de culture sélectifs et, pour les bactéries lactiques, par une approche indépendante d'isolements bactériens par culture. Cette dernière consistait en l'analyse de la séquence des régions V1 et V2 de l'ADNr 16S, amplifiées à partir de l'ADN extrait du grain. La sensibilité de la méthode a été augmentée à cette occasion en dissociant les amplifications géniques des populations lactiques minoritaires et majoritaires du grain. La flore identifiée dans le grain KJ comprenait Acetobacter sp., Kazachstania exigua, Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum, Lb. kefiri, Lb. parakefiri, Lactococcus lactis subsp. lactis et Leuconostoc mesenteroides, et était dépourvue de microcoques, de pédiocoques, de Weissella viridescens, de bactéries indicatrices de défauts d'hygiène, de Salmonella sp. et de Listeria monocytogenes. Dans le but de vérifier le caractère complet des espèces mises à jour, une reconstitution du grain à partir des micro-organismes qui en ont été isolés a été envisagée. Des conditions expérimentales favorables à la formation de grains dans un substrat lacté ont été recherchées à partir d'extraits du grain KJ renfermant un consortium microbien a priori complet. Ces essais de reconstitution n'ont pas conduit à la formation de grains de kéfir mais l'un d'eux a conduit à la formation de biofilms. Cet évènement a été reproduit dans du lait de façon répétable avec des consortiums reconstitués à partir des micro-organismes individuels isolés du grain KJ. Ninane Véronique Louise (2008). Characterisation of the microbial consortium of a kefir grain (Thèse de doctorat in French). Gembloux, Belgium Gembloux Agricultural University, 197 p., 16 tabl., 16 fig. Summary: Kefir grains are dairy starters composed of a complex and diversified microflora. The one of a kefir grain (KJ) was characterised by a classical methodological approach of microbial isolation on selective culture media and, for the lactic acid bacteria, by a culture-independent approach. This latter was the sequence analysis of the 16S rDNA V1 and V2 regions amplified from a grain DNA extract. At this occasion, the sensitivity of the method was increased by splitting up the genetic amplification of the less abundant lactic acid population from that of more abundant ones. The microflora identified in the kefir grain KJ included Acetobacter sp., Kazachstania exigua, Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum, Lb. kefiri, Lb. parakefiri, Lactococcus lactis subsp. lactis and Leuconostoc mesenteroides, and was free of micrococci, pediococci, Weissella viridescens, indicator bacteria of sanitary defaults, Salmonella sp. and Listeria monocytogenes. With the aim to verify the completeness of the identified species, a reconstitution of the grain from the isolated micro-organisms was envisaged. Experimental conditions favourable to a grain formation in a milky substrate were searched with extracts of the KJ grain that contained a theoretical complete consortium. These trials of grain reconstitution didn't lead to the formation of kefir grains but one of them led to the formation of biofilms. This event was repeatably reproduced in milk with consortiums that were reconstituted from the individual micro-organisms isolated from the KJ grain. Copyright. Aux termes de la loi belge du 22 mars 1886, sur le droit d'auteur, seul l'auteur a le droit de reproduire cet ouvrage ou d'en autoriser la reproduction de quelque manière et sous quelque forme que ce soit. Toute photocopie ou reproduction sous autre forme est donc faite en violation avec la loi. Ce travail fut une expérience intense, passionnante et enrichissante, Qui, sans vous, Chers parents, chers amis, chers collègues, N'aurait pas vu le jour. Pour votre patience, vos encouragements et vos judicieux conseils, Je tiens à vous dire MERCI. SOMMAIRE RÉSUMÉ 3 SUMMARY 7 1 INTRODUCTION 11 1.1 Grains de kéfir 13 1.2 Préparation et qualité du kéfir 24 1.3 Perspectives de développement 35 1.4 Méthodes d’identification des bactéries lactiques 46 1.5 Objectifs du travail 55 2 MATÉRIEL ET MÉTHODES 59 2.1 Matériel biologique 59 2.2 Qualité hygiénique du grain de kéfir KJ 60 2.3 Identification et quantification des groupes microbiens du grain de kéfir KJ 61 2.4 Identification moléculaire des bactéries lactiques du grain de kéfir KJ 64 2.5 Isolement des micro-organismes du grain de kéfir KJ et identification des isolats 69 2.6 Formation du grain de kéfir KJ 73 3 RÉSULTATS 77 3.1 Qualité hygiénique du grain de kéfir KJ 77 3.2 Identification et quantification des groupes microbiens du grain de kéfir KJ 79 3.3 Identification moléculaire des bactéries lactiques du grain de kéfir KJ 85 3.4 Identification des isolats microbiens 100 3.5 Formation du grain de kéfir KJ 111 4 DISCUSSION 129 4.1 Qualité hygiénique du grain de kéfir KJ 129 4.2 Identification et quantification des groupes microbiens du grain de kéfir KJ 133 4.3 Identification moléculaire des bactéries lactiques du grain de kéfir KJ 139 4.4 Composition microbienne du grain de kéfir KJ 146 4.5 Formation du grain de kéfir KJ 149 5 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 157 5.1 Caractéristiques microbiennes du grain de kéfir KJ 157 5.2 Atouts, contraintes et performances de la méthode moléculaire d'identification des bactéries lactiques 160 5.3 Avancées en matière de reconstitution d'un grain de kéfir 162 ANNEXE I : ANCIENNES DÉNOMINATIONS DES MICRO-ORGANISMES DU KÉFIR 167 1 ANNEXE II : CODE DES ACIDES NUCLÉIQUES DE L'UNION INTERNATIONALE DE BIOCHIMIE (CORNISH- BOWDEN, 1985). 169 BIBLIOGRAPHIE 171 LISTE DES DOCUMENTS PUBLIÉS DANS LE CONTEXTE DE CE TRAVAIL 187 LISTE DES FIGURES 189 LISTE DES TABLEAUX 191 TABLE DES MATIÈRES 193 2 RÉSUMÉ RÉSUMÉ Les grains de kéfir sont des ferments lactiques constitués d'une microflore complexe et diversifiée. Celle d’un grain de kéfir sélectionné pour ses qualités organoleptiques et technologiques, le grain KJ, a été caractérisée du point de vue de sa composition microbienne tant qualitative que quantitative. Les groupes microbiens participant au consortium ont été identifiés par la méthode classique d'isolements sur des milieux de culture sélectifs. Elle a révélé la présence dans le grain KJ de lactobacilles, de coques lactiques, de leuconostocs, de bactéries acétiques et de levures. Parallèlement, elle a montré que le grain KJ était dépourvu de microcoques, de pédiocoques, de Weissella viridescens, de bactéries indicatrices de défauts d'hygiène ainsi que des germes de la flore pathogène prévalant dans nos régions et susceptible de se développer dans cette matrice (Listeria monocytogenes et Salmonella sp.). L'identification de Acetobacter sp. et de Kazachstania exigua, la bactérie acétique et la levure du grain KJ, a été déterminée par des méthodes phénotypiques et/ou moléculaires appliquées à des souches isolées du grain. L'identification de la flore lactique du grain KJ, plus diversifiée dans les grains que la flore acétique et plus délicate à mettre en évidence par culture que les levures, a été effectuée par une approche indépendante d'isolements bactériens par culture. Elle consistait en l'analyse de séquences du gène codant pour l'ARNr 16S amplifiées à partir de l'ADN directement extrait d'un grain. L'identification des bactéries à l'origine des séquences a été déterminée par comparaison avec des séquences d'origine connue. La comparaison portait sur de courtes régions ciblées de l'ADNr 16S, d'une centaine de nucléotides. Le pouvoir discriminant des régions ciblées de l'ADNr 16S était suffisant pour garantir une identification fiable des lactobacilles et des coques lactiques de grains de kéfir au niveau taxonomique de l'espèce mais n'autorisait une identification fiable des leuconostocs qu'au niveau du genre. Dans l’approche appliquée, le nombre de séquences examinées détermine la sensibilité de la méthode. Il a été rationalisé en dissociant l'ADNr 16S des populations lactiques minoritaires et majoritaires du grain à l'occasion de l'amplification génique. Le nombre de séquences examinées dans chacun des pools d'amplification a été fixé de façon à détecter les espèces dominantes de tous les groupes lactiques identifiés dans le grain de kéfir KJ et de ceux dont la présence était pressentie sur base des données de la littérature : lactobacilles homofermentaires, lactobacilles hétérofermentaires, coques lactiques 3 RÉSUMÉ et leuconostocs. Cette stratégie a révélé la présence dans le grain KJ de cinq espèces lactiques : Lactobacillus kefiranofaciens, Lb. kefiri, Lb. parakefiri, Lactococcus lactis et Leuconostoc sp. La diversité des bactéries lactiques qu'elle a permise de mettre en évidence dans le grain KJ était représentative de celle de grains de kéfir. L'identification moléculaire des bactéries lactiques a été confirmée par une analyse des caractéristiques phénotypiques de souches isolées du grain KJ. Elle a, parallèlement, été précisée à des niveaux taxonomiques plus fins pour les taxons le requérant. L'identification de Lactobacillus kefiranofaciens subsp. kefirgranum et de Lactococcus lactis subsp. lactis a été précisée à partir de leur profil fermentaire et celle de Leuconostoc mesenteroides, à partir du profil de migration de uploads/Industriel/ caracteres-physico-chimiques-microbiologiques-et-nutritionnels-pdf.pdf