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COURS DE BIOTECHNOLOGIE VEGETALE CULTURE IN VITRO (Cours : module biotechnologi

COURS DE BIOTECHNOLOGIE VEGETALE CULTURE IN VITRO (Cours : module biotechnologies végétales (Cours : module biotechnologies végétales Module M Module M 33 33 Pr Pr Guédira Guédira ) 10 h: techniques de culture in vitro (Pr Guédira) 5h: Amélioration classique Amélioration classique (Pr Triqui) 6 h : transformation génétique (Pr Bendaou) 1. Définitions a) La biotechnologie est ensemble de techniques biologiques appliquées pour la production appliquées pour la production de la biomasse à partir de cellules animales ou végétales. b) Les biotechnologies végétales sont des biotechnologies –techniques industrielles- où le matériel industrielles- où le matériel végétal constitue la matière première. c)Les biotechnologies végétales utilisent la culture des tissus végétaux afin d’améliorer la production agricole ou industrielle. Elles permettent l’amélioration et la production des plantes . Les principaux buts des biotechnologies végétales sont : La multiplication massive de plantes saines et/ ou hybrides avec éventuellement une production commerciale. la création de nouveaux génotypes par: •Sélection de variants somaclonaux ou gamétoclonaux intéressants présentant des caractères de résistance aux stress biotiques ou résistance aux stress biotiques ou abiotiques). •Haplométhodes (gamètes) • fusion de protoplastes • transformation génétique Utilisation des cellules végétales pour la production massive de molécules à forte valeur ajoutée métabolites secondaires: métabolites secondaires: médicaments, biocarburants (alcool canne à sucre)……… La culture des tissus : terme général pour indiquer la culture indiquer la culture aseptique et in vitro d’un explant. Un explant: * graine * organe (feuille, racine… * morceau d’organe * un un tissu tissu(méristème, épiderme, * un un tissu tissu(méristème, épiderme, phloème ….) * cellule * protoplaste Deux types de cellules 1. Cellules meristématiques: - petites isodiamétriques , - N/C élevé, - N/C élevé, -mitoses actives - pas de méats intercellulaires. 2. Différenciation cellulaire: spécialisation de la forme et de la fonction Au niveau de la cellule avec l’âge. Au niveau de la cellule avec l’âge. Cellules grandes fonctions précise peu ou pas de division. Dédifférenciation cellulaire: les cellules différenciées peuvent se transformer en cellule transformer en cellule non différenciée grâce à la culture in vitro Epiderme de l’hypocotyle du lin cellules différenciées témoin Epiderme au début du traitement avec la BAP DEBUT DE DIVISION DES NOYAUX FORMATION DE CELLULES MERISTEMATIQUES La culture in vitro : se base sur la propriété de la dédifférenciation cellulaire imposée par la culture cellulaire imposée par la culture in vitro Totipotence: aptitude de la cellule végétale à exprimer la totalité de ses potentialités la totalité de ses potentialités pour donner un organisme entier. La totipotentialité cellulaire s'accompagne par multiplication indéfinie que l'on peut observer dans les zones de croissance de la dans les zones de croissance de la plante : les méristèmes, cellules restant dans un état de dédifférenciation permanent. 2. Historique de la CULTURE IN VITRO 1902 HABERLANDT : pensait isoler des cellules pensait isoler des cellules puis les rassembler pour constituer un tissu 1934 White (USA): croissance indéfinie de pointe de racine de tomate pointe de racine de tomate (macro et micro+ vit B1 et B2) 1939 WHITE : prolifération cellulaire tomate (macro et micro+ tomate (macro et micro+ vit B1 et B2 et auxine). 3. Caractéristiques des techniques de la culture des in vitro a.Asepsie: en absence de microbes qui peuvent envahir le milieu et qui peuvent envahir le milieu et introduire des éléments inconnus (toxines) dans le milieu de culture Présence de matières organiques dans le milieu Nécessité de l’asepsie Risque de prolifération de contaminants Maintien de la propreté du laboratoire Stérilisation des milieux par autoclavage ou ultrafiltration Mise en culture dans des conditions aseptiques Autoclave Stérilisation des Stérilisation des milieux à la vapeur d’eau par autoclavage 1 bar(120°C) pendant 20 mn Stérilisation des milieux de culture par filtration : filtre millipore 22µm pour les substance pour les substance thermolabile (zéatine… vitamines ….) Mise en culture: flux laminaire: paillasse balayée par l’air filtré stérilisé Le manipulateur doit rincer ses mains avec une solution mains avec une solution antiseptique. Il faut aussi éviter toutes les actions pouvant amener des contaminants comme la parole, la toux Etc. Tous les instruments utilisés doivent être doivent être flambés après immersion à l’alcool Verrerie, papiers… à l’étuve l’étuve 180°C (à sec)pendant 2h Stérilisation du matériel végétal Méthode dépend: - des conditions de culture de la plante mère, plante mère, - explant réside ou non, - âge, état sanitaire, proximité du sol, type de pathogènes Produit utilisés pour une désinfection superficielle (externe) -Laver bien à l’eau puis -rinçage rapide dans l’alcool 70 °C °C -Hypochlorite de Ca ou de Na 20mn puis rinçage - organes prétraitements traitements Post-traitements semences Immersion Alcool 70°C 10’-20’ Ca(ClO)2 10% 20-30’ 3 lavages eau stérile fruits fleurs Laver avec coton imbibé Alcool 70°C Na(ClO)2 2% 10’ idem tiges Eau courante Na(ClO)2 2% idem Exemples de traitements pour la stérilisation tiges Eau courante Puis frotter avec coton imbibé Alcool 70°C Na(ClO)2 2% 5-30’ idem Organes de réserves Eau courante (long temps) Na(ClO)2 2% 20-30’ idem feuilles Laver rapide Alcool 70°C Hgcl2 0,1% 1’ (chlorure de mercure) 6 lavages -Utilisation des antibiotiques dans le cas infections bactériennes externe : Pénicilline Rifampicine Infections bactériennes interne : antibiotiques dans le milieu de culture ( problème: variants) b. Milieu de culture: La composition du milieu de culture est totalement connue: La composition du milieu de culture dépend de beaucoup de culture dépend de beaucoup de facteur dont les plus importants sont : le matériel végétal (espèce, variété, cultivar. .Etc.), le type d’explant (taille), l’objectif de la culture. L’eau et les sels minéraux essentiels. Le milieu de Murashige et Skoog en 1962 est le plus largement utilisé. Les matières organiques comprenant un sucre et des En général, le milieu comprend: comprenant un sucre et des vitamines. Des régulateurs de croissance. Le pH du milieu est en général ajusté vers 5.8 par quelques gouttes de NaOH ou Hcl. Un gélifiant pour maintenir l’explant en surface. Certaines espèces nécessitent de fortes teneurs en ions pour pousser, tandis que d’autres pousser, tandis que d’autres connaissent des toxicités aux sels Macro-élements MS mg/l g/l S. mère NH4NO3 - - 1650 33,0 KNO3 - - 1900 38,0 CaCl2 . 2H2O - 440 8,8 CaCl2 . 2H2O - 440 8,8 MgSO4 .7H2O - 370 7,4 KH2PO4 - - 170 3,4 Micro-élements milieu solution-mère (mg/l) (x xxx) g/l H3BO3 - - - - 6,2 - - 620,0 MnSO4 .4H2O - - - 22,3 - - 2230,0 ZnSO4 .4H2O - - - 8,6 - - 860,0 KI - - - - 0,83 - - 83,0 Na2MoO4 .2H2O - - - 0,25 - - 25,0 CuSO4.5H2O - - - 0,025- - 2,5 CuSO4.5H2O - - - 0,025- - 2,5 CoCl2 .6H2O - - - 0,025- - 2,5 FeSO4 ;7H2O 27,8 2780,0 Na2EDTA 37,3 3730,0 Les régulateurs de croissance : Les auxines et les cytokinines sont les plus utilisés L’AUXINE 1926, Went : Découverte d’une substance de 1926, Went : Découverte d’une substance de croissance, l’acide indole acétique : AIA Stimulation de l'élongation cellulaire, de la rhyzogenèse (racines). La synthèse de l'auxine s'effectue dans les apex méristématiques des tiges, et dans les jeunes feuilles des bourgeons terminaux. Le transport de l'auxine s'effectue de façon polarisée, de l'apex vers la base dans la tige. LES CYTOKININES 1941: Blakeslee, essaie de créer des hybrides entre différentes espèces de Datura, les embryons meurent. L’utilisation de lait de coco (un albumen liquide) permet de les faire développer in vitro 1948: le lait de coco, active la prolifération plus que l’auxine et permet la culture de tissus ne répondant pas à l’auxine 1962: la molécule active du lait de coco a les caractéristiques d’une base nucléique Indépendamment Skoog et Miller 1957, Isolement de la kinétine d’extrait de levure, Zéatine d’albumen de maïs, zéatine de lait de coco en 1974 . kinétine Stimule la division cellulaire et l’organogenèse Synthèse dans les racines Synthèse dans les racines puis migrent dans la plante via la sève brute (xylème) Rôle des auxines et des cytokinines dans l’organogenèse Le rapport auxines / cytokinines détermine le devenir des tissus en culture, Notion de balance hormonale - En concentrations égales->division de cellules indifférenciées - Auxine -> formation de racines - Cytokinines -> bourgeons Exemple d'organogenèse contrôlées par des concentrations relatives d'auxines et de cytokinines Hypocotyle du lin . Fortes [auxines] associées ou non à faibles [cytokinines], favorisent la formation de racines sur cal ainsi que l'enracinement des tiges feuillées des tiges feuillées • Fortes [cytokinines] + faibles [auxines], favorisent développement des bourgeons axillaires ou adventifs et donc la multiplication des plantes. . Auxines Cytokinines Rhizogenèse sur cal Rhizogenèse sur boutures • [Auxines & Cytok ] équilibrées : prolifération anarchique (cal) de cellules qui ne peuvent s'organiser en tissus et organes distincts. Rhizogenèse sur boutures callogenèse Bourgeonnements adventifs Bourgeonnements axillaires C. Incubation des cultures Les cultures sont incubées dans une salle climatisée qui permet de stabiliser les facteurs suivants: La température: stable. La lumière: intensité, photopériode. Humidité relative parfois même si c’est souvent un facteur secondaire. Les chambres de culture sont souvent des salles climatisées équipées d’étagères en bois surmontées de tubes uploads/Industriel/ cours-biotechnologie-vegetale-2016-2017.pdf