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République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Sup

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur Et de la Recherche Scientifique Université de Jijel Faculté des sciences Département de Biologie moléculaire et cellulaire Option: microbiologie appliquée Degré: Master I Exemple de production d’hormone Préparé par Proposé par:Mme Barhi *Bellal .Ch *Boudjelida .H *Kaaboub .K Année universitaire: 2011/2012 Introduction En raison de l’impossibilité pour la chimie de synthèse de mettre au point certaines macromolécules à usage thérapeutique, en raison également des dangers présentés par les protéines d’extraction d’origine humaine ou animale, il a fallu recourir à d’autres stratégies pour obtenir de grandes quantités de ces molécules selon l’éventail très large des besoins et qui soient, de plus, de qualité satisfaisante C’est ainsi que la production d’OGM à visée thérapeutique a pris naissance, selon des modalités qui ne sont pas toutes au même stade de développement. Près de 80 principes actifs sont actuellement produits par culture de cellules procaryotes (E. coli) ou eucaryotes (hamster chinois) dont la majorité n’aurait pas pu être obtenus par synthèse chimique et dont certains permettent le traitement de maladies restées incurables jusqu’à présent. Il devient possible aujourd'hui, en s'appuyant sur ces méthodologies, de reprogrammer le code génétique d'un micro-organisme en lui insérant un gène précis, qui lui permettra de produire une protéine recombinante précieuse (à usage médical -interféron, insuline, hormone de croissance...- ou industriel -enzymes...-) . Quelles sont les étapes d’un procédé générale de production d’hormone ? Chapitre I: Généralité sur les protéines recombinantes I. Définition Protéine produite par expression d’un ADN recombiné inséré dans le génome d’une bactérie, d’un plasmide ou d’une lignée cellulaire (pour que ce gène soit exprimé, il doit être précédé d’un promoteur efficace). Une protéine recombinée produite par une bactérie a partir d’un gène d’eucaryote n’a pas toujours les propriétés de la protéine originale. I.2. Procédé général de production  dans un procédé général de production dit « biotechnologique » l’expression d’une protéine d’intérêt thérapeutique est assurée par un système cellulaire génétiquement modifie . ). I.2.1. Etape préalable à toute production « la mise au point du système d’expression, notion du génie génétique »  Le gène codant pour la séquence protéique d’intérêt est le premier élément de ce système, puisque seule une séquence génique correcte permettra d’obtenir l’expression d’une protéine dont la séquence primaire sera conforme.  Le gène le plus souvent de séquence humaine, doit être inséré dans la cellule qui aura été choisie comme système hôte pour la production. ).  La biotechnologie a donc pour but d’insérer un transgène codant pour la protéine à produire dans un organisme producteur « système d’expression ». Ce lui ci est conservé sous forme de banques cellulaires « banques maitresses et de travail »pour garantir la reproductibilité du système de production. Les cellules issues des banques cellulaires sont mises en culture afin de produire la protéine d’intérêt ).  Cellules hôtes et système d’expression Les hôtes les plus utilisés à l'heure actuelle sont incontestablement:  la bactérie Escherichia coli : pour la production de: hormone de croissance humaine, insuline, chymosine, interféron- , interleukine-2..) la levure Saccharomyces cerevisiae: pour la production de: antigène de surface du virus de l'hépatite B, insuline, hirudine... autres bactéries : Bacillus subtilis, Streptomyces ).  Notion de banque cellulaire Afin d’assurer l’homogénéité et la reproductibilité de la production de la protéine d’intérêt, un système de « banque cellulaire » ou encore appelé système de lot de semence à deux niveaux est établé à partir du clone producteur initialement sélectionné . ).  la banque cellulaire maitresse issue directement de l’amplification de clone sélectionné (MCB).  banque cellulaire de travail (WCB) amplifiant un ou deux tubes /ampoules de la MCB. ). I.2.2. Conditions de fermentation ou de culture cellulaire Une fois que le système d’expression a été construit, la cellule hôte génétiquement modifiée et le clone producteur établit en banque, il faut procéder à la mise en culture de la cellule hôte afin que celle- ci produise, dans des conditions de culture spécifiques et optimisées, la protéine d’intérêt. ). La culture de ces organismes se fait dans des fermenteurs ou des systèmes de culture cellulaire. Les conditions de culture, la façon dont la cellule hôte est entretenue, nourrie, oxégénée,…sont autant d’éléments déterminants dans les rendements de production et dans la qualité intrinsèque de la protéine produite. I.2.3 la purification L’objectif de cette purification est d’extraire le produit et d’éliminer l’ensemble des substances dites contaminantes, notamment celle issus des cellules productrices, des matières premières utilisée (réactifs, milieu de culture…) ainsi que les produits de dégradation.  Un second objectif de la purification est d’éliminer les agents pathogènes (virus) A l’issue de ce procédé , on obtient une protéine dite purifiée dont le degré de pureté doit être qualifié et vérifié par apport à des normes fixées. • On observe ainsi qu’un changement de pH, modification de la pression partielle d’oxygène ou encore une modification dans la vitesse des apports en hydrate de carbone entraine des modifications. I.2.4. La mise en forme pharmaceutique Cette étape consiste à inclure la protéine d’intérêt thérapeutique sous une forme permettra son administration au patient. il faut donc préparer un médicament qui sera administré par voie injectable. pour cela il faut procéder à la mise au point d’une formule avec des expédients dont le rôle sera d’assurer la meilleur solubilisation possible de la protéine et le maintien de son intégrité physique et chimique. Chapitre II Exemple de production d’ hormones II.1. Définition Une molécule chimique produite par une cellule endocrine et libérée dans le sang. Elle agit sur des cellules cibles qui possèdent les récepteurs fixant spécifiquement l’hormone. II.2. Exemples de production industrielle d’hormone • L’hormone de croissance est une protéine de 191 acides aminés qui est produite par l’hypophyse et qui régule la croissance et le développement. Les enfants nés avec une déficience en hormone de croissance - des nanismes hypophysaires- n’atteignent jamais une taille normale. *Des injections régulières d’hormone de croissance stimulent la croissance de ces enfants afin qu’ils aient un jour des tailles presque normales. II.2.1. L’hormone de croissance Les hormones de croissance animales s'étant montrées inefficaces, il a fallu recourir à l'hormone de croissance humaine hGH , extraite de l'hypophyse d'êtres humains après leur décès ̎ Jusqu'en 1985, celle-ci était fabriquée par extraction, après la mort, de cerveaux humains̎ . Cela a présenté deux inconvénients :  la quantité d'hormones ainsi prélevée était insuffisante pour traiter l'ensemble des cas (un cas sur deux) ; ces prélèvements humains pouvaient contenir des agents infectieux (Creutzfeldt-Jacob, VIH ...) Figure 1 :Place de l'hypophyse humaine par rapport à l'encéphale. http://www.gnis-pedagogie.org En 1977, la production massive d'hormones a été obtenue à partir de bactéries génétiquement modifiées, c'est-à-dire contenant le gène de croissance humaine.  Procédé de fabrication de l’hormone de croissance Etape 1: identification et isolement du fragment d'ADN humain contenant le gène de l'hormone de croissance. Figure2:Extraction du gène[6] • Etape2 : Insertion du fragment d'ADN humain dans un plasmide . Introduction du plasmide modifié dans la bactérie Escherichia coli. Figure3:Création de vecteur recombiné Figure4:transfert de plasmide recombiné • Etape 3 : Expression du gène humain et synthèse de l'hormone de croissance par les bactéries placées en culture sur un milieu approprié dans un fermenteur.  Culture Les cellules bactériennes sont d'abord multipliées dans de petits bioréacteurs (fermenteurs) contenant une solution nutritive. La durée de la multiplication dépend du cycle de croissance des cellules. Les cellules d’ E. coli se divisent toutes les 20 minutes. En l'espace de 24 heures et dans des conditions idéales, une seule et unique cellule peut donc produire 4,7 x 1021 descendants. La fermentation C'est durant cette phase qu'a lieu la véritable production de l’hormone de croissance après contrôle de la température, la pression, l'oxygénation et d'autres paramètres encore. Pour éviter toutes mutations, un lot de semence primaire de bactéries productrices d'hormones sert de référence pour toutes comparaisons avec les bactéries cultivées dans les fermenteurs. L'hormone est rejetée au delà de la membrane cytoplasmique et elle apparaît tout à fait identique à l'hormone de croissance humaine. Une seule cuve contenant 500 litres produit la même quantité d'hormones de croissance que 35 000 hypophyses humaines. Figure5: Expression de gène[7] Etape 4 : on peut récupérer l'hormone sans détruire la bactérie, ce qui évite tout risque de contamination par des molécules ou des virus contenus dans la bactérie. l'hormone n'est pas rejetée dans le milieu extérieur, il s'accumule dans un espace situé entre la membrane cytoplasmique et la paroi. Il suffit alors de dissoudre cette paroi pour récupérer l'hormone de croissance Figure6:Extraction de l’hormone de croissance La purification La purification doit se faire dans les meilleures conditions afin de préserver l'intégrité et les propriétés de l’hormone.  Fondamentalement, la purification est basée sur la chromatographie d'affinité. Toutefois, si un grand degré de pureté est souhaité, nous associons d’autres techniques chromatographique : échange ionique, filtration sur gel, chromatographie d'interaction hydrophobe. La mise en forme pharmaceutique  Seules quelques grandes compagnies pharmaceutiques mondiales disposent les moyens de produire d’hormone de croissance. Elle est alors disponible sous forme injectable, mais l'obtention d'un traitement uploads/Industriel/ les-hormones.pdf