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i Master en Pharmacie Travail Personnel de Recherche Contrôle de la qualité microbiologique (biocharge et pyrogénicité) des matières premières de qualité pharmaceutique présenté à la Faculté des sciences de L’Université de Genève par Lara Bell Unité de recherche Directeur de l’unité Pharmacie centrale du CHUV Prof. Farshid Sadeghipour Responsables Dr. Markoulina Berger Dr. Grégory Podilsky Genève 2017 i REMERCIEMENTS En préambule à ce travail, je souhaiterais adresser mes remerciements aux personnes qui m’ont aidée et qui m’ont apporté leur soutien tout au long de la réalisation de ce présent travail. En premier lieu, je tiens à remercier le Professeur Farshid Sadeghipour occupant le poste de Pharmacien-chef à Lausanne à la pharmacie du CHUV, pour son aide précieuse et le temps qu’il m’a consacré. Je remercie également la Docteure Markoulina Berger, Pharmacienne responsable de l’unité du Contrôle Qualité à la Pharmacie du CHUV, pour sa disponibilité, son aide et ses précieux conseils qui m’ont permis d’avancer tout au long de mon travail. Je la remercie également pour les réponses qu’elle m’a apportées, ses encouragements et son soutien durant ce stage. Je souhaite aussi remercier le Docteur Gregory Podilsky, Pharmacien responsable de l’unité de production, pour ses propositions relatives à mon projet. Je remercie également Mme Christine Leblanc Bonnet-Eymard, Pharmacienne responsable des productions en séries pour son écoute et ses suggestions. Je tenais à remercier de plus, la pharmacienne adjointe du Docteure Markoulina Berger, Mme Camille Fauchère, qui m’a donné de nombreuses pistes de recherche et idées pour progresser dans ce travail. Je remercie également Mme Julie Thibaudeau, experte en microbiologie de l’unité du Contrôle qualité chez B.Braun Medical, pour ses réponses à mes questions et pour ses rendez-vous téléphoniques. Je souhaite remercier aussi Mme May Arcin, Laborantine en chimie pour son aide et sa formation pour la partie microbiologie. Je remercie de même tous les autres laborantins et apprentis du laboratoire du contrôle qualité pour leur aide pour les manipulations et leur participation pour favoriser mon intégration au sein de l’unité. Mes remerciements se tournent également vers les membres de ma famille qui m’ont soutenue et incitée à donner le meilleur de moi-même. ii RÉSUMÉ INTRODUCTION Beaucoup de matières premières employées à l’hôpital proviennent de Chine et d’Inde, pays dans lesquels les autorités réglementaires ne peuvent assurer des audits régulièrement, ni des contrôles suffisants.18,19 Il paraît donc important de vérifier la qualité des matières premières utilisées pour la fabrication de préparations pharmaceutiques. Le but de ce travail est d’évaluer la qualité microbiologique (endotoxines et biocharges) sur une sélection de matières premières utilisées pour des préparations injectables et/ou solutions orales et ainsi de vérifier l’absence d’endotoxines et germes pathogènes dans ces matières premières. L’applicabilité de la méthode utilisée pour évaluer la biocharge des matières premières a aussi été vérifiée pour 5 matières premières testées. (Benzoate de Sodium Atropine Sulfate, Sodium Thiosulfate, Lactate de Sodium et Calcium Hydrogénophosphate Dihydraté). MATÉRIELS ET MÉTHODES Le taux d’endotoxines présentes dans les matières premières a été évalué par la méthode de colorimétrie cinétique avec l’appareil Endosafe®MCS de Charles River.16,17 La biocharge des différentes matières premières a été quantifiée par les méthodes de dénombrement de germes aérobies totaux, moisissures/levures et recherche germes spécifiés, par filtration (produits hydrosolubles) ou ensemencement direct (produits non hydrosolubles).21 RÉSULTATS ET DISCUSSION Les matières premières sélectionnées présentent toutes des taux d’endotoxines et une biocharge respectant les normes établies par la Ph. Eur. 21 En effet, aucun lot de matière première testé ne présentait une quantité d’endotoxines supérieure aux limites exigées par la Ph.Eur. Certaines matières premières présentaient des faibles contaminations microbiennes mais aucun germe pathogène n’a été détecté. La vérification de l’applicabilité de la méthode a permis de mettre en évidence que certaines matières premières analysées ont des propriétés physico-chimiques antimicrobiennes, notamment pour le Benzoate de Sodium et le Sodium Thiosulfate. Dans ce cas-ci, une neutralisation avant filtration de la matière première est indispensable. CONCLUSION ET PERSPECTIVES Les résultats obtenus pour les endotoxines et la biocharge sont conformes aux normes exigées par la Ph.Eur.21 Les matières premières sélectionnées peuvent être utilisées en toute sécurité au sein de l’hôpital pour la préparation de médicaments injectables et solutions orales. La reproductibilité de ces résultats entre les différents lots doit être évaluée par la suite. iii ABRÉVIATIONS A. brasiliensis Aspergillus brasiliensis BPF Bonnes Pratiques de Fabrication B. subtilis Bacillus subtilis C. albicans Candida albicans CHUV Centre Hospitalier Universitaire Vaudois CMI Concentration minimale inhibitrice CV Coefficient de variation CSE Control standard Endotoxin DGAT Dénombrement des germes aérobies totaux DMLT Dénombrement des moisissures/levures totales DMS Dilution maximale significative E. coli Escherichia coli GS Gélose au sang ICH International Conference on Harmonisation IV Intraveineuse LAL Lysat d’amoebocytes de limule LPS Lipopolysaccharide McC Mac Conkey MCS Multi-Cartridge System Ph.Eur. Pharmacopée Européenne pNA P-nitroanaline P. aeruginosa P. aeruginosa PTS Portable Test System RVS Rappaport-Vassiliadis S. aureus Staphylococcus aureus SDA Sabouraud Dextrose Agar TLR4 Toll-like receptor 4 TSA Tryptone soya agar TSB Trypticase soy broth UE Unité d’endotoxine UFC Unité Formant Colonie UI Unité internationale USP United States Pharmacopeia iv TABLE DES MATIÈRES 1. INTRODUCTION ............................................................................................................... 1 1.1 Le contrôle de qualité microbiologique des matières premières ................................... 1 1.2 Contexte du travail de recherche ................................................................................. 2 1.3 Objectifs du travail de recherche .................................................................................. 2 1.4 LES ENDOTOXINES .................................................................................................. 2 1.4.1 Étymologie et découverte des endotoxines ............................................................... 2 1.4.2 Présence des endotoxines ........................................................................................ 3 1.4.3 Structure chimique des endotoxines ......................................................................... 3 1.4.4 Les symptômes et effets sur la santé ....................................................................... 3 1.4.5 Méthodes de contrôle d’endotoxines ......................................................................... 4 1.4.6 Limites en endotoxines autorisées ............................................................................ 4 1.4.7 Dilution maximale significative .................................................................................. 5 1.5 Facteurs d’interférences : activité inhibitrice et activatrice ........................................... 5 1.6 CONTRÔLE MICROBIOLOGIQUE ................................................................................. 6 1.6.1 Introduction ............................................................................................................... 6 1.6.2 Recherche de germes aérobies totaux ...................................................................... 6 1.6.3 Recherche de levures et moisissures ........................................................................ 6 1.6.4 Recherche de germes spécifiés ................................................................................ 6 1.7. Méthodes de contrôle microbiologique des produits non stériles .................................... 8 1.7.1 Filtration sur membrane ............................................................................................ 8 1.7.2 Méthode d’ensemencement ...................................................................................... 8 1.7.3 Méthode du nombre le plus probable ........................................................................ 8 1.8 Limites fixées pour les critères d’acceptations ............................................................. 8 1.9 Validation des méthodes de dénombrement (applicabilité de la méthode) ................... 9 2 MATÉRIEL ET MÉTHODES ..............................................................................................10 2.1 Matériel .......................................................................................................................10 2.1.1 Produits : matières premières ...............................................................................10 2.1.2 Matériel nécessaire pour l’analyse des endotoxines .............................................10 2.1.3 Matériel pour le contrôle microbiologique des produits non stériles ..........................11 2.2 Méthode .........................................................................................................................11 2.3 Mode opératoire: contrôle microbiologique des produits non stériles ..............................12 3. RÉSULTATS .................................................................................................................13 3.1 Mesure du taux d’endotoxines par la méthode Endosafe®-MCSTM Charles River ...13 3.2 Résultats contrôle microbiologique .........................................................................15 3.2.1 Contrôle de la biocharge des différentes matières premières ...................................15 v 3.2.2 Résultats d’identifications .........................................................................................17 3.2.3 Essais de fertilités des Salmonelles .........................................................................18 3.3. Validation de la méthode de dénombrement en présence du produit .........................18 4. DISCUSSION ...................................................................................................................27 4.1 Mesure du taux d’endotoxines par la méthode Endosafe®-MCSTM Charles River ........27 4.2 Contrôle de la biocharge des matières premières sélectionnées ................................28 4.3 Essais de fertilité .........................................................................................................29 4.4 Validation de la méthode de dénombrement en présence du produit ..........................29 5. CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................................................................34 6. BIBLIOGRAPHIE ..............................................................................................................35 7. ANNEXES ........................................................................................................................37 1 1. INTRODUCTION 1.1 Le contrôle de qualité microbiologique des matières premières Les Bonnes Pratiques de Fabrication ne sont pas harmonisées au niveau mondial. Or, actuellement les principaux fournisseurs des matières premières pharmaceutiques sont la Chine et l’Inde. La production hospitalière doit en effet, employer de nombreuses matières premières provenant de ces pays et leur qualité doit être conforme à la Pharmacopée Européenne. 26, 27 En milieu hospitalier, le contrôle microbiologique représente une exigence réglementaire au niveau des produits pharmaceutiques injectables, des produits utilisables en dialyse et du matériel chirurgical.22 Lorsqu’un médicament est administré par une voie jugée critique comme la voie intraveineuse, la préparation doit être dépourvue de pyrogènes pouvant engendrer de graves effets secondaires chez le patient.21 Les pyrogènes sont définis comme étant des substances pouvant provoquer une brusque élévation de la température.3 Cette classe de pathogène est variée. Elle regroupe les molécules de nature virale, fongique et bactérienne, dont les endotoxines et lipopolysaccharides (LPS) qui nous intéressent plus particulièrement. Il s’agit de toxines contenues dans la membrane externe de bactéries Gram négatif, qui sont libérées uniquement au moment de la lyse bactérienne. L’exposition d’un patient à des doses extrêmement faibles en endotoxines peut avoir des conséquences graves, notamment en raison de l’activité des endotoxines sur le système immunitaire. Elles peuvent provoquer des fièvres élevées, une vasodilatation importante des vaisseaux, une coagulation intravasculaire ou un choc septique.11 De plus, une atteinte des voies respiratoires est souvent signalée : les endotoxines peuvent induire un asthme ou l’aggraver1-9,14-15,32. De surcroît, les endotoxines sont très résistantes aux procédés de stérilisation employés en routine tels que la stérilisation par la chaleur humide ou la filtration microbiologique.15 En raison des dangers potentiels des endotoxines pour le patient et de leur résistance aux procédés de stérilisation, la présence des endotoxines dans les produits pharmaceutiques notamment dans les préparations injectables doit impérativement être contrôlée. Historiquement, le contrôle des pyrogènes se faisait de façon in vivo sur les lapins. Actuellement, les procédés d’analyse et de recherche d’endotoxines reposent sur l’utilisation du lysat uploads/Industriel/ travail-ecrit-version-finale-16-06-17-version-finale-a-imprimer-ok.pdf