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UNIVERSITÉ DU QUÉBEC MÉMOIRE PRÉSENTÉ À L'UNIVERSITÉ DU QUÉBEC A CHICOUTIMI COM

UNIVERSITÉ DU QUÉBEC MÉMOIRE PRÉSENTÉ À L'UNIVERSITÉ DU QUÉBEC A CHICOUTIMI COMME EXIGENCE PARTIELLE DE LA MAÎTRISE EN RESSOURCES RENOUVELABLES PAR MOHAMMED BOUHAJIB B.Sc. (CHIMIE) ANALYSE DES GLYCOSIDES DE PICEA MARIANA (Mill.) B.S.P. MAI 1992 bibliothèque Paul-Emile-Bouletj UIUQAC Mise en garde/Advice Afin de rendre accessible au plus grand nombre le résultat des travaux de recherche menés par ses étudiants gradués et dans l'esprit des règles qui régissent le dépôt et la diffusion des mémoires et thèses produits dans cette Institution, l'Université du Québec à Chicoutimi (UQAC) est fière de rendre accessible une version complète et gratuite de cette œuvre. Motivated by a desire to make the results of its graduate students' research accessible to all, and in accordance with the rules governing the acceptation and diffusion of dissertations and theses in this Institution, the Université du Québec à Chicoutimi (UQAC) is proud to make a complete version of this work available at no cost to the reader. L'auteur conserve néanmoins la propriété du droit d'auteur qui protège ce mémoire ou cette thèse. Ni le mémoire ou la thèse ni des extraits substantiels de ceux-ci ne peuvent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation. The author retains ownership of the copyright of this dissertation or thesis. Neither the dissertation or thesis, nor substantial extracts from it, may be printed or otherwise reproduced without the author's permission. RÉSUMÉ Dans ce projet de recherche nous avons analysé les glycosides de l'épinette noire. Cette analyse comporte deux parties: 1) - l'analyse des glycosides sans transformation chimique. Les glycosides sont extraits du matériel végétal sec par solvant Par des techniques de chromatographie liquide (CCM, CLP et CLHP), quatre glycosides phénoliques sont purifiés. Des structures basées sur des données spectroscopiques ( RMN XH et 13C et SM) sont proposées. Dans les quatre glycosides, le sucre est le (5-D-glucose. 2) - l'analyse des aglycones des glycosides après hydrolyse. Une fois les substances volatiles éliminées de l'extrait des glycosides, ce dernier subit un hydrolyse enzymatique pour libérer les aglycones. Deux enzymes sont utilisées pour comparer leur efficacité de l'hydrolyse des glycosides. Les aglycones libérées sont extraites par le pentane et le pentane et l'éther (l:l/v:v), et analysées par chromatographie en phase gazeuse sur deux colonnes capillaires (DB-5 et Supelco-10). La comparaison des pourcentages relatifs des aglycones a révélé que la (3-glucosidase est plus efficace pour hydrolyser les glucosides phénoliques et la cellulase est plus efficace pour hydrolyser les glucosides monoterpéniques. Étant donné l'importance des glycosides comme source supplémentaire de produits volatils de l'épinette noire, l'objectif de ce travail était d'évaluer la qualité et la quantité des aglycones des glycosides et d'analyser la structure de certains glycosides par des méthodes spectroscopiques. Ill REMERCIEMENTS Je tiens à remercier très sincèrement toutes les personnes qui de près ou de loin ont contribué à la réalisation de ce projet Ces remerciements vont principalement à mon directeur de thèse, le professeur François-Xavier Garneau pour sa disponibilité, son esprit critique, son enthousiasme et son soutient financier manifestés lors de la réalisation de l'ensemble du projet. Je remercie également le professeur Guy J.Collin pour ses conseils et son support logistique qui m'ont permis de mener à bien cette recherche. J'offre également mes remerciements au professeur Michel J. Gagon pour sa collaboration technique sur le CG-SM et le professeur John ApSimon pour sa collaboration sur le SM et RMN. Je tiens aussi à remercier Mmes. Francine Belleau, et Hélène Gagnon et M. André Barrette pour leur soutien technique. Ce travail a été réalisé grâce à l'appui cité plus haut, mais aussi grâce à mes parents et mon frère Abdelah qui m'ont donné la chance d'entreprendre un tel travail hors de mon pays. Et je remercie grandement la fondation de l'Université du Québec à Chicoutimi (FUQAC) pour avoir subventionné ce projet de recherche. IV TABLE DES MATIÈRES RÉSUMÉ ii REMERCIEMENTS iii LISTE DES FIGURES viii LISTE DES TABLEAUX ix LISTE DES ANNEXES x LISTE DES ABRÉVIATIONS xi SECTION I : REVUE DE LITTÉRATURE ET MATÉRIEL 1 CHAPITRE I : REVUE DE LA LITTÉRATURE SUR LES GLYCOSIDES PRÉCURSEURS D'ARÔMES 2 INTRODUCTION 2 1.2 MÉTHODES D'EXTRACTION DES GLYCOSIDES 5 U MÉTHODES D'ANALYSE DES GLYCOSIDES 9 CHAPITRE II: DESCRIPTION BOTANIQUE DE P1CEA MARIANA (Mill) B.S.P. 12 2.1 GÉNÉRALITÉS 12 2.2 DESCRIPTION DE L'ARBRE. 13 2.3 DISTRIBUTION GÉOGRAPHIQUE 15 2.4 SITE D'ÉCHANTILLONNAGE 16 SECTION II : MÉTHODES D'EXTRACTION ET D'ANALYSE DES GLYCOSIDES 17 CHAPITRE I : QUELQUES PRINCIPES ET THÉORIES DES MÉTHODES D'EXTRACTION DE PURIFICATION ET D'ANALYSE. 18 1.1 MÉTHODES D'EXTRACTION 18 1.1.1 Extraction au Soxhlet 19 1.1.2 Extraction liquide-liquide 19 1.1.3 Extraction avec un appareil Likens-Nickerson 21 1.2 LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE 22 1.2.1 La chromatographie liquide sur couche mince (CCM) 24 1.2.2 Chromatographie liquide à basse pression sur colonne preparative 28 1.2.2.1 Remplissage de la colonne preparative 28 12.22 Paramètres d'optimisation d'une séparation sur colonne 31 1223 Séparation sur la colonne preparative à basse pression 32 12.3 Chromatographie liquide à haute pression (CLHP) 33 1.2.3.1 Quelques principes et théorie de la chromatographie 36 1.2 LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE (CG) ET LA CG-SM 41 1.2.1 Chromatographie en phase gazeuse (CG) 41 1.2.2 La CG couplée à un spectromètre de masse (CG-SM) 42 1.3 LA RÉSONANCE MAGNÉTIQUE NUCLÉAIRE (RMN) *H et 13C 44 a) Théorie de la RMN 45 b) Déplacement chimique 46 c) Couplage de deux spins 48 CHAPITRE II: MÉTHODES EXPÉRIMENTALES APPLIQUÉES À L'ÉTUDE DES GLYCOSIDES DE PICEA MARIANA 50 2.1 EXTRACTION DES GLYCOSIDES INTACTS 50 2.2 ANALYSE DES GLYCOSIDES INTACTS 53 2.2.1 Analyses et séparation des glycosides par CL 53 2.2.1.1 Analyse par CCM 53 VI 2.2.1.2 Séparation sur colonne preparative 55 2.2.1.3 Chromatographie CLHP 56 2.2.2 Analyse des glycosides par RMN (ïH et 13C) et SM 57 2.3 ANALYSE DES AGLYCONES DES GLYCOSIDES 57 2.3.1 Hydrolyse enzymatique des glycosides 57 2.3.2 Hydrolyse acide des glycosides 58 23.3 Analyse des aglycones par CG et CG-SM 58 SECTION III : Résultats 61 CHAPITRE 1 : EXTRACTION, PURIFICATION ET ANALYSES DES GLYCOSIDES INTACTS 62 1.1 EXTRACTION ET PURIFICATION DES GLYCOSIDES INTACTS 62 1.1.1 Extraction et pré-purification des glycosides 62 1.1.2 Purification des glycosides par CLHP 65 U ANALYSES DES GLYCOSIDES PAR LARMNDU^ET^CETSM 68 CHAPITRE 2 : EXTRACTIONS ET ANALYSES DES AGLYCONES LIBÉRÉES PAR HYDROLYSE ENZYMATIQUE 77 2.1 ANALYSE DES AGLYCONES LIBÉRÉES PAR HYDROLYSE ENZYMATIQUE. 77 2.2 ANALYSE DES AGLYCONES LIBÉRÉES PAR HYDROLYSE ACIDE 82 SECTION IV : DISCUSSION 84 CHAPITRE I : EXTRACTION ET PURIFICATION DES GLYCOSIDES 85 1.1 EXTRACTION DES GLYCOSIDES 85 vii 1.2 PURIFICATION DES GLYCOSIDES 86 CHAPITRE II: INTERPRÉTATION DES DONNÉES SPECTROSCOPIQUES 90 2.1 DÉTERMINATION DES STRUCTURES DES GLYCOSIDES 90 CHIMIQUES DU 1H et 13c 99 2.2.1 GLUCOSIDE#1 99 2.2.2 GLUCOSIDE#2 107 2.2.3 GLUCOSIDE#3 111 2.2.4 GLUCOSIDE#4 115 CHAPITRE III : ANALYSES DES AGLYCONES OBÉRÉES PAR HYDROLYSES 119 3.1 EXTRACTION ET ANALYSES DES AGLYCONES 119 3.2 AGLYCONES LIBÉRÉES PAR HYDROLYSES ENZYMATIQUES.... 121 3.2.1 Comparaison de l'efficacité des deux enzymes 122 3.2.2 Nature et abondance des aglycones dans les conifères 123 a) Alcools aliphatiques non terpéniques 123 b) Alcools aromatiques 124 c) Les monoterpènes 125 CONCLUSION 131 ANNEXE 134 BIBLIOGRAPHIE 169 VIII LISTE DES FIGURES Figure 1 : Voie de métabolisme de d-néomenthyl-b-D-glucoside dans les rhizomes de la menthe 4 Figure 2 : Voie de conversion du camphre en glucoside. 5 Figure 3 : Photos des différentes parties de Picea mariana 14 Figure 4 : Distribution naturelle de l'épinette noire 15 Figure 5 : Site de l'échantillonnage de Picea mariana 16 Figure 6 : Schéma d'un extracteur de Soxhlet 20 Figure 7 : Schéma d'un extracteur de Iikens-Nïkersori , 20 Figure 8 : Montage de remplissage des colonnes à haute pression 30 Figure 9 : Les composantes principales d'un système CLHP 35 Figure 10: Mesure du degré de séparation entre deux pics 40 Figure 11 : Plan d'extraction, de purification et d'analyse des glycosides intacts 51 Figure 12: Plan d'extraction et d'hydrolyse des glycosides intacts et analyse des aglycones libérées 52 Figure 13: Analyse des fractions de CLP par CCM 64 Figure 14: Optimisation de la séparation des fractions 32 à 42 regroupées 66 Figure 15: Séparation des glycosides des tractions 74 à 109 regroupées 67 Figure 16: Quelques glucosides aromatiques modèles 96 Figure 17: Mécanisme de fragmentation du glucose 100 Figure 18: Les six structures possibles pour le glucoside #1 103 Figure 19: Structure complète du glucoside #1 106 Figure 20: Mécanisme de fragmentation de l'aglycone 106 Figure 21: Structure complète du glucoside #2 110 Figure 22: Mécanisme de fragmentation de l'aglycone 110 Figure 23: Structure complète du glucoside #3 114 Figure 24: Structure complète du glucoside #4 118 IX LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Comparaison entre deux méthodes d'extraction des aglycones après hydrolyse 8 Tableau 2 : Conditions d'opérations typiques de la CLBP-P 31 Tableau3 : Caractéristiques des principaux détecteurs de la CG 43 Tableau 4 : Conditions chromatographiques 60 Tableau 5 : Déplacements chimiques de RMN du Glucoside #1 70 Tableau 6 : Déplacements chimiques de RMN du Glucoside #2 73 Tableau 7 : Déplacements chimiques de RMN du Glucoside #2 et #3 74 Tableau 8 : Déplacements chimiques de RMN uploads/Litterature/ analyse-des-glycosides-de.pdf